Una proteína aislada que comprende:

a) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO:

5);

b) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 6);

c) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS (SEQ ID NO: 17);

d) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS madura (SEQ ID NO: 18);

e) la secuencia de aminoácidos de Met-Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 26); o

f) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) en la que un residuo de cisteína en la posición correspondiente a los residuos 48, 52, 59, 63, 65 ó 76 o la asparagina en la posición 51 ó 82 se ha sustituido.

Nuevos antagonistas de quimioquinas CXC

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a nuevos antagonistas de quimioquinas CXC, particularmente antagonistas de CXCL8 y quimioquinas CXC relacionadas, y a sus usos, particularmente como compuestos anti-inflamatorios o inmunomoduladores y en el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con las quimioquinas CXC.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las quimioquinas son proteínas pequeñas, secretadas, pro-inflamatorias, que median la migración direccional de los leucocitos desde la sangre hasta el sitio de la lesión. Dependiendo de la posición de las cisteínas conservadas que caracterizan a esta familia de proteínas, la familia de las quimioquinas puede dividirse estructuralmente en quimioquinas C, CC, CXC y CX3C que se unen a una serie de receptores de membrana (Baggiolini M et al., 1997) . Estos receptores de membrana, todos receptores heptahelicoidales acoplados a proteína G, permiten a las quimioquinas ejercer su actividad biológica en las células diana, que pueden presentar combinaciones específicas de receptores según su estado y/o tipo. Los efectos fisiológicos de las quimioquinas resultan de un sistema complejo e integrado de interacciones concurrentes: los receptores tienen frecuentemente especificidad superpuesta de ligando, de manera que un único receptor puede unirse a diferentes quimioquinas. Una única quimioquina también puede unirse a diferentes receptores.

Los estudios sobre las relaciones estructura-actividad indican que las quimioquinas tienen dos sitios principales de interacción con sus receptores, la región amino terminal flexible y el bucle conformacionalmente rígido que está después de la segunda Cisteína. Se piensa que las quimioquinas se acoplan a los receptores mediante la región de bucle y se cree que este contacto facilita la unión de la región amino terminal que resulta en la activación del receptor.

Habitualmente, las quimioquinas se producen en el sitio de la lesión y causan la migración y activación de los leucocitos, jugando un papel fundamental en los procesos inflamatorios, inmunes, homeostáticos, hematopoyéticos y angiogénicos. Así, estas moléculas se consideran buenos candidatos diana para la intervención terapéutica en enfermedades asociadas con dichos procesos. La inhibición de las quimioquinas, o de sus receptores, puede reducir la maduración, reclutamiento y activación de los leucocitos, así como otros procesos patológicos relacionados con la angiogénesis o la arteriosclerosis (Baggiolini M, 2001) .

Además de quimioquinas, anticuerpos y péptidos mutantes inhibidores y de pequeñas moléculas inhibidoras que bloquean los receptores, la búsqueda de antagonistas eficaces de las quimioquinas se ha extendido también a una serie de virus y otros organismos que, cuando entran en contacto con huéspedes humanos o mamíferos, muestran actividades inmunomoduladoras potentes que afectan al huésped.

El mimetismo viral de las citoquinas, quimioquinas y sus receptores puede indicar estrategias de inmunomodulación para desarrollar productos terapéuticos. Recientemente, se han revisado los factores inmunomoduladores expresados por los artrópodos hematófagos (tales como mosquitos, flebótomos y garrapatas) (Gillespie, RD et al, 2001) .

En particular, las glándulas salivares de las garrapatas producen una mezcla compleja de moléculas bioactivas que tienen, en particular, actividades anti-inflamatorias, anti-hemostáticas y anti-inmunes. Éstas incluyen proteínas bioactivas que controlan la histamina, se unen a inmunoglobulinas o inhiben la cascada alternativa del complemento u otras proteasas.

A pesar de la gran cantidad de bibliografía, sólo unos pocos artículos listan secuencias de ADNc identificadas por secuenciación aleatoria y cribados diferenciales de bibliotecas generadas a partir de varios tejidos y/o especies de garrapata. Sin embargo, la gran mayoría de estas secuencias no se han caracterizado bioquímicamente o funcionalmente, y se introducen muchas anotaciones sólo tomando como base la similitud de secuencia con proteínas conocidas implicadas en funciones celulares básicas, tales como las caracterizadas previamente en las glándulas salivares de las garrapatas para actividades enzimáticas o para inducir respuesta de anticuerpos. En particular, no hay ninguna indicación de proteínas de garrapata que actúen como proteínas de unión a la quimioquinas CXC y que funcionen como antagonistas de las quimioquinas CXC.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

De manera sorprendente, se ha encontrado que la saliva de Rhipicephalus sanguineus (garrapata de perros) contiene una nueva proteína denominada Evasina-3, que se une a las quimioquinas CXC e inhibe su actividad. La Evasina-3 se clonó a partir de una biblioteca de ADNc de Rhipicephalus sanguineus y se expresó en células de mamífero y de E. coli. Esta proteína, así como derivados, fragmentos o miméticos de ésta, pueden usarse terapéuticamente, por ejemplo, como antagonistas de las quimioquinas CXC en organismos mamíferos, o como dianas para la vacunación y para el control de garrapatas y de patógenos transmitidos por garrapatas.

Un primer aspecto de la invención se refiere así a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la Evasina-3 o de un análogo de ésta. Los polipéptidos preferidos de esta invención se unen a una quimioquina CXC e inhiben su actividad biológica. Un ejemplo específico de dicho polipéptido es Evasina-3.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido como se ha definido anteriormente. Dichos ácidos nucleicos también incluyen oligonucleótidos asilados de ellos y vectores que contiene dichas moléculas, en particular vectores de expresión.

Un tercer aspecto de esta invención se basa en anticuerpos que se unen selectivamente a los polipéptidos como se han definido anteriormente.

Un cuarto aspecto de esta invención se refiere a células huésped que expresan un polipéptido como se ha definido anteriormente.

Un quinto aspecto de esta invención es un proceso para preparar un polipéptido como se ha definido anteriormente, usando típicamente tecnologías recombinantes.

Un sexto aspecto de la invención es una composición farmacéutica (incluyendo una vacuna o inmunogénica) que comprende un polipéptido como se ha definido anteriormente y un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido como se ha definido anteriormente como un medicamento, en particular para la preparación de un medicamento para regular una respuesta inmune o inflamatoria en un mamífero.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de Evasina-3 con traducción del marco de lectura abierto (ORF) . La secuencia señal (residuos 1-26) , predicha por el algoritmo SIGNALP, está subrayada. El sitio de poliadenilación predicho está incluido en una caja. Los residuos de Cisteína presentes en la proteína madura están resaltados. Los sitios predichos de glicosilación asociada a N están en negrita.

Figura 2: Secuencia de nucleótidos y traducción del ADNc de Evasina-3 compatible Gateway que contiene sitios attB flanqueantes 5' y 3' generados por dos ciclos sucesivos de PCR. Las flechas indican la posición y sentido de los cebadores de PCR relevantes (las secuencias de los cebadores están listadas en la Tabla III) . Los codones de inicio y de parada están en negrita. La secuencia señal predicha está subrayada.

Figura 3: (A) Mapa del vector de entrada Gateway pDONR221_Evasina-3-6HIS. (B) Mapa del vector de expresión Gateway pDEST8_Evasina-3-6HIS para expresión en células TN5 (insecto) . (C) Mapa del vector de expresión Gateway pEAK12d_evasina3-6HIS para expresión en células de riñón embrionario humano HEK293/células EBNA.

(D) Mapa del vector de expresión pEXPII-evasina3-6HIS para expresión en células HEK293/EBNA.

Figura 4: Autorradiografía del gel de SDS-PAGE que muestra el complejo formado por el entrecruzamiento de quimioquina CXC CXCL8 (IL-8) marcada con 125I con sobrenadantes de células HEK293 transfectadas con Evasina3 recombinante, usando el agente de entrecruzamiento BS3. Carril 1, la proteína viral de unión... [Seguir leyendo]

1. Una proteína aislada que comprende: a) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) ; b) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 6) ; c) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS (SEQ ID NO: 17) ; d) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS madura (SEQ ID NO: 18) ; e) la secuencia de aminoácidos de Met-Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 26) ; o f) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) en la que un residuo de cisteína en la posición

correspondiente a los residuos 48, 52, 59, 63, 65 ó 76 o la asparagina en la posición 51 ó 82 se ha sustituido.

2. La proteína aislada según la reivindicación 1, en la que dicha proteína consiste en: a) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) ; b) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 6) ; c) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS (SEQ ID NO: 17) ; d) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS madura (SEQ ID NO: 18) ; e) la secuencia de aminoácidos de Met-Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 26) ; o f) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) en la que un residuo de cisteína en la posición

correspondiente a los residuos 48, 52, 59, 63, 65 ó 76 o la asparagina en la posición 51 ó 82 se ha sustituido.

3. La proteína aislada según la reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende además una o más secuencias de aminoácidos elegidas entre las siguientes: un dominio extracelular de un proteína unida a membrana, una región constante de inmunoglobulina, un dominio de multimerización, una hormona proteica heterodimérica, un péptido señal, una señal de exportación o una secuencia etiqueta unida de manera operativa a dicha proteína.

4. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína aislada según la reivindicación 1 ó 3.

5. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, en la que dicha molécula codifica una proteína que comprende: a) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) ; b) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 6) ; c) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS (SEQ ID NO: 17) ; d) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS madura (SEQ ID NO: 18) ;

e) la secuencia de aminoácidos de Met-Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 26) ; o f) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) en la que un residuo de cisteína en la posición correspondiente a los residuos 48, 52, 59, 63, 65 ó 76 o la asparagina en la posición 51 ó 82 se ha sustituido.

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína aislada según la reivindicación 2.

7. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que dicha molécula codifica una proteína que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) ; b) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 6) ; c) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS (SEQ ID NO: 17) ; d) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3-HIS madura (SEQ ID NO: 18) ;

e) la secuencia de aminoácidos de Met-Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 26) ; o f) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) en la que un residuo de cisteína en la posición correspondiente a los residuos 48, 52, 59, 63, 65 ó 76 o la asparagina en la posición 51 ó 82 se ha sustituido.

8. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que dicha molécula es una molécula de ADN, particularmente una molécula de ADNc.

9. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, en la que dicha molécula comprende o es una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3 ó 15.

10. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, en la que dicha molécula comprende o es una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 4 ó 25.

11. Un vector de clonación o de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.

12. Un vector de expresión según la reivindicación 11 que comprende además un promotor asociado de manera operativa con dicha molécula de ácido nucleico, en particular un promotor específico de tejido, uno constitutivo o uno inducible.

13. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 11 ó 12.

14. Un proceso para preparar una proteína aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 13 bajo condiciones que permitan o estimulen la expresión de dicha proteína.

15. El proceso según la reivindicación 14, que comprende además purificar la proteína.

16. El proceso según la reivindicación 14 ó 15, que comprende además formular la proteína para la administración a seres humanos.

17. Un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína que tiene: a) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 (SEQ ID NO: 5) ; b) la secuencia de aminoácidos de Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 6) ; o c) la secuencia de aminoácidos de Met-Evasina-3 madura (SEQ ID NO: 26) .

18. Un anticuerpo según la reivindicación 17, que es un anticuerpo monoclonal.

19. Una composición farmacéutica que comprende una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición farmacéutica según la reivindicación 19 para usarse como un medicamento.

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