MOLÉCULA DE ADN CIRCULAR QUE TIENE UN ORIGEN DE REPLICACIÓN CONDICIONAL, PROCESOS PARA SU PREPARACIÓN Y SU USO EN TERAPIA GÉNICA.

Molécula de ADN circular que tiene un origen de replicación condicional, procesos para su preparación y su uso en terapia génica La presente invención se refiere a una nueva molécula de ADN con replicación condicional que puede usarse en terapia génica o para la producción de proteínas recombinantes. Las nuevas moléculas de ADN según la presente invención se designan pCOR de aquí en adelante en la presente memoria. La terapia génica consiste en corregir una deficiencia o una anomalía introduciendo información genética en el órgano o célula afectada. Esta información puede introducirse tanto in vitro dentro de una célula extraída del órgano y reinyectándola en el cuerpo, o in vivo, directamente en el tejido diana. Como una molécula de alto peso molecular y con carga negativa, el ADN tiene dificultad para atravesar espontáneamente las membranas celulares fosfolipídicas. Varios vectores se usan así con el fin de permitir que tenga lugar la transferencia génica: vectores virales, por una parte, y vectores naturales o sintéticos químicos y/o bioquímicos, por otra parte. Los vectores virales (retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, etc.) son muy eficaces, en particular para atravesar las membranas, pero presentan un determinado número de riesgos tales como patogenicidad, recombinación, replicación e inmunogenicidad. Los vectores químicos y/o bioquímicos permiten evitar estos riesgos (para revisiones, véase Behr, 1993, Cotten y Wagner 1993). Éstos son, por ejemplo cationes (fosfato de calcio, DEAE-dextrano, etc.) que actúan formando precipitados con ADN, que pueden ser "fagocitados" por las células. También pueden ser liposomas en los que el ADN se incorpora y que se fusionan con la membrana plasmática. Los vectores de transferencia génica sintéticos son generalmente lípidos o polímeros catiónicos que forman un complejo con el ADN y forman con él una partícula que presenta cargas superficiales positivas. Como ilustraciones de vectores de este tipo, puede mencionarse en particular dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, Transfectam ) o N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA, Lipofectin ). Sin embargo, el uso de vectores químicos y/o bioquímicos o ADN desnudo implica la posibilidad de producir grandes cantidades de ADN con pureza farmacológica. La razón para esto es que en las técnicas de terapia génica, el producto medicinal consiste en el ADN en sí mismo y es esencial tener la capacidad de fabricar, en cantidades adecuadas, ADN que tengan las propiedades que son apropiadas para el uso terapéutico en el ser humano. En el caso de vectorología no viral, los vectores usados son plásmidos de origen bacteriano. Los plásmidos usados generalmente en terapia génica portan (i) un origen de replicación, (ii) un gen marcador tal como un gen para resistencia a un antibiótico (kanamicina, ampicilina, etc.) y (iii) uno o más transgenes con secuencias necesarias para su expresión (amplificador(es), promotor(es), secuencias de poliadenilación, etc.). Sin embargo, la tecnología disponible actualmente no es completamente satisfactoria. Por una parte, permanece el riesgo de diseminación en el cuerpo. Así, una bacteria que está presente en el cuerpo puede, a baja frecuencia, recibir este plásmido. Existe una mayor probabilidad de que esto tenga lugar si implica un tratamiento de terapia génica in vivo en el que el ADN puede diseminarse en el cuerpo del paciente y puede entrar en contacto con bacterias que infectan a este paciente o bacterias de la flora comensal. Si la bacteria que recibe el plásmido es una enterobacteria, tal como E. coli, este plásmido puede replicarse. Dicho evento da lugar a la diseminación del gen terapéutico. Desde el momento en el que los genes terapéuticos usados en los tratamientos de terapia génica pueden codificar, por ejemplo, una linfoquina, un factor de crecimiento, un anti-oncogén o una proteínas cuya función es defectuosa en el huésped y que hace así posible corregir un defecto genético, la diseminación de algunos de estos genes podría tener efectos impredecibles y preocupantes (por ejemplo, si una bacteria patógena adquiere un gen de factor de crecimiento humano). Por otra parte, los plásmidos usados generalmente en terapia génica no viral también poseen un marcador para resistencia a un antibiótico (ampicilina, kanamicina, etc.). La bacteria que adquiere dicho plásmido tiene así una ventaja selectiva innegable ya que cualquier terapia con antibiótico, usando un antibiótico de la misma familia de la que selecciona el gen de resistencia del plásmido, dará lugar a la selección del plásmido en cuestión. A este respecto, la ampicilina pertenece a las -lactamas, que es la familia de antibióticos que se usa más frecuentemente en el mundo. El uso en bacterias de marcadores de selección que no son genes de resistencia a antibióticos sería así particularmente ventajoso. Esto evitaría la selección de bacterias que pueden haber recibido un plásmido que porta dicho marcador. WO9710343 describe la cepa XAC-1 pir116 (ara, (lac-proB)x111, gyrA, argEam, rpoB, thi, uidA(Mlul)::pir116/F'[proB + lacl373 lacZu118am]). SOUBRIER ET AL (GENE THERAPY, vol. 6, 1999, 1482-1488) y CARRIÈRE ET AL (S.T.P. PHARMA SCIENCES, vol. 11, no. 1, 2001, 1-6), también describen ambos la cepa XAC pir116, así como un derivado traD de dicha cepa. MIRON ALEXANDER ET AL (PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 91, no. 14, 1994, 6438-6442) describe la caracterización de varias mutaciones pir, 2   incluyendo pir 42, pero no describe ni sugiere hacer dobles mutantes y usarlos para incrementar el número de copias. Es así particularmente importante esforzarse para limitar la diseminación de genes terapéuticos y genes de resistencia lo máximo posible. La invención se refiere a la reivindicación 1. Las moléculas de ADN tienen la ventaja de eliminar los riesgos asociados con la diseminación del plásmido, tales como (1) replicación y diseminación, que pueden dar lugar a la sobreexpresión incontrolada del gen terapéutico, (2) diseminación y expresión de genes de resistencia. La información genética contenida en las moléculas de ADN según la invención comprende efectivamente el o los genes terapéuticos y las señales para regular su expresión, un origen de replicación condicional funcional que limita en gran medida el espectro de célula huésped de este plásmido, un marcador de selección con un tamaño reducido que es preferiblemente diferente de un gen que confiere resistencia a un antibiótico y, cuando sea apropiado, un fragmento de ADN que permite la resolución de los multímeros de plásmido. La probabilidad de que estas moléculas (y así la información genética que contienen) sea transferida a un microorganismo, y mantenida de manera estable es muy limitada. Por último, los vectores según la invención, también referidos como miniplásmidos debido a su estructura circular, su tamaño reducido y su forma superenrollada, tienen las ventajas adicionales siguientes: debido a su tamaño que es reducido en comparación con los plásmidos derivados de ColE1 usados convencionalmente, las moléculas de ADN según la invención tienen potencialmente mejor biodisponibilidad in vivo, y las moléculas de ADN o pCOR permanecen en una forma extracromosómica estable en las células huésped procariotas o eucariotas que no contienen la proteína iniciadora. En particular, tienen capacidades mejoradas de penetración y distribución en la célula. Así, se sabe que el coeficiente de difusión en los tejidos es inversamente proporcional al peso molecular (Jain, 1987). De manera similar, en la célula, las moléculas de alto peso molecular tienen una menor permeabilidad a través de la membrana plasmática. Además, con el fin de que el plásmido pase al interior del núcleo, que es esencial para su expresión, el alto peso molecular también es una desventaja, imponiendo los poros nucleares un límite de tamaño para la difusión en el interior del núcleo (Landford et al., 1986). La reducción del tamaño de las partes no terapéuticas de la molécula de ADN (origen de replicación y gen de selección en particular) según la invención también hace posible disminuir el tamaño de las moléculas de ADN. La parte que permite la replicación y selección de este plásmido en la bacteria (1 kb) disminuye por un factor de 3, contando, por ejemplo, 3 kb para el origen de replicación y la parte del vector de marcador de resistencia. Esta disminución (i) en peso molecular y (ii) en carga negativa confiere una biodisponibilidad y difusión tisular, celular y nuclear mejoradas a las moléculas de la invención. Más precisamente, la presente invención se refiere a una molécula de ADN circular, que es útil en terapia génica, comprendiendo esta molécula al menos una secuencia... [Seguir leyendo]

1. Una célula huésped recombinante procariota que comprende un gen pir heterólogo que codifica una proteína pi y una molécula de ADN extracromosómica que comprende un gen terapéutico heterólogo y un origen de replicación condicional cuya funcionalidad en la célula huésped recombinante procariota requiere la proteína pi, en el que el gen pir heterólogo comprende al menos una mutación además de la mutación pir116, seleccionándose dicha mutación adicional del grupo que consiste en que el residuo 130 de la proteína pi sea una valina, el residuo 292 de la proteína pi sea una metionina o el residuo 117 de la proteína pi sea una glicina. 2. La célula huésped recombinante procariota de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el gen pir heterólogo está en un plásmido. 3. La célula huésped recombinante procariota de la reivindicación 1, en la que el gen pir heterólogo está en el genoma de la célula huésped. 4. La célula huésped recombinante procariota de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el origen de replicación condicional es de un plásmido bacteriano o un bacteriófago. 5. La célula huésped recombinante procariota de la reivindicación 4, en la que el origen de replicación condicional es de R2K, R6K, RI, pSC101, Rtsl, F, RSF1010, P1, P4, lambda, Phi82 o Phi80. 6. La célula huésped recombinante procariota de la reivindicación 5, en la que el origen de replicación condicional es del plásmido bacteriano R6K. 7. La célula huésped recombinante procariota de la reivindicación 6, en la que el origen de replicación comprende la SEQ ID NO: 1. 8. La célula huésped recombinante procariota de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en la que el plásmido comprende además un gen de selección que no confiere resistencia a un antibiótico. 9. La célula huésped recombinante procariota de la reivindicación 8, en la que el gen de selección codifica un ARN de transferencia supresor para codones específicos. 10. La célula huésped recombinante procariota de la reivindicación 8, en la que el gen de selección es un ARN de transferencia supresor de ámbar y la célula huésped comprende además un gen que comprende una mutación ámbar. 11. La célula huésped recombinante procariota de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula huésped es deficiente para el gen endA. 12. La célula huésped recombinante procariota de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula huésped es deficiente para el gen traD. 13. La célula huésped recombinante procariota de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha célula huésped comprende además un gen recA mutado. 14. Un método para producir un plásmido que comprende un gen terapéutico heterólogo y un origen de replicación condicional cuya funcionalidad en una célula huésped procariota requiere una proteína iniciadora de la replicación extraña para la célula huésped, que comprende: a) cultivar la célula huésped recombinante procariota de cualquiera de las reivindicaciones anteriores bajo condiciones en las que se produce el plásmido; y b) aislar el plásmido. 51   52   53   54     56   57   58   59     61   62   63   64     66   67   68   69     71   72   73   74     76   77   78   79     81