Modelo de ratón para soriasis y artritis soriática.

Ratón deficiente en c-Jun y JunB en los queratinocitos debido a la deleción de los genes c-Jun y JunB en los queratinocitos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/000517.

Solicitante: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: CD PATENTS, BINGER STRASSE 173 55216 INGELHEIM ALEMANIA.

Inventor/es: WAGNER, ERWIN, ZENZ,Rainer.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01K67/027 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA; OBTENCION DE ANIMALES, NO PREVISTA EN OTRO LUGAR; NUEVAS RAZAS DE ANIMALES.A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
  • A61K49/00 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones para examen in vivo.
  • C07K14/82 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Productos de traducción de oncogenes.
  • C12N15/85 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células animales.
  • C12N15/90 C12N 15/00 […] › Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

PDF original: ES-2386287_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Modelo de ratón para soriasis y artritis soriática.

La invención se refiere al campo de la soriasis.

La soriasis, que afecta a aproximadamente el 2% de la población, es uno de los trastornos de la piel humana más comunes que afecta a la piel y a las articulaciones. Se caracteriza por complejas alteraciones de diversos tipos celulares. Entre ellas se incluyen la hiperproliferación epidérmica y alteraciones de la diferenciación, así como angiogénesis y dilatación de los vasos sanguíneos dérmicos (Schön, 1999; Lebwohl, 2003) . Además, se observa un infiltrado leucocítico mixto. Está compuesto de linfocitos T activados, neutrófilos dentro de la dermis y microabscesos epidérmicos, macrófagos de revestimiento y un número incrementado de mastocitos dérmicos. Las citoquinas, entre ellas el factor α de necrosis tumoral (TNF-α) , la interleuquina-1 (IL-1) , el interferón γ (INF-γ) , IL-6, IL-8, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor α de crecimiento transformante (TGF-α) se cree que median en las alteraciones del tejido psoriático (Schön, 1999) .

Durante décadas la controversia ha sido si la soriasis resulta de anormalidades primarias en la epidermis o si presenta una base inmunológica (Nickoloffet al., 2000) . Aunque se acumula la evidencia de que presenta una base inmunológica, otros autores interpretan que la soriasis es un patrón de respuesta epitelial anormal determinado genéticamente frente a la infección y/o a insultos físicoquímicos a la piel.

Se ha puesto de manifiesto que la piel soriática es un caldo de cultivo de factores de crecimiento epidérmico y mediadores inflamatorios. La evidencia en apoyo de un papel crucial para dichos mediadores procede de pacientses que responden a las terapias inmunosupresoras, antiinflamatorias y antiproliferativas, tales como ciclosporina, metotrexato, tacrolimus, corticoesteroides y psoralén activado por luz ultravioleta. Sin embargo, los grandes esfuerzos destinados a dirigir mediadores inflamatorios y factores de crecimiento de los queratinocitos a la piel no han reproducido por completo el fenotipo soriático (Xiaet al., 2003) , que de esta manera hasta el momento sólo ha sido modelado fielmente en animales mediante trasplante de piel soriática a ratones con síndrome de inmunodeficiencia combinada severa (SCID) . Hasta el momento ningún modelo de ratón informado imita todas las características observadas en la soriasis en el ser humano, incluyendo la artritis soriática, que se encuentra presente en hasta 40% de los pacientes de soriasis.

Debido a que no existe ninguna enfermedad de la piel animal de origen natural que sea similar tanto en fenotipo como en inmunopatogénesis a la soriasis, la investigación sobre la patogénesis de este trastorno común de la piel se ha visto severamente dificultada.

En consecuencia, existe una necesidad de un modelo animal eficiente y significativo para el estudio de la soriasis y para el ensayo de candidatos a fármacos efectivos en el tratamiento de este trastorno.

Es un objetivo de la invención proporcionar un modelo animal para la soriasis, incluyendo la artritis soriática.

La solución del problema subyacente a la invención se basa en los mecanismos moleculares asociados al factor de transcripción AP-1.

El factor de transcripción AP-1 es generado por una serie de dímeros de productos de las familias de proteínas Fos, Jun y CREB/ATF (Eferl y Wagner, 2003) , así como por otras proteínas bZip. Además, se han observado asociaciones entre Fos o Jun y la subunidad p65 de NFκB (Steinet al., 1993) y ATF-2 y p50-NFκB (Du et al., 1993) . La asociación combinatorial puede utilizar algunos de los genes siguientes: los tres genes Jun (c-Jun, JunB, JunD) , los cuatro genes Fos (c-Fos, FosB, Fra-1, Fra2) y algunos de los genes CREB/ATF. A pesar del elevado grado de homología de las características estructurales globales, los diferentes miembros de las familias de Fos, Jun y CREB muestran diferencias significativas, que conducen a diferencias sutiles de unión y activación transcripcional del ADN (Angel y Herrlich, 1994) , sugiriendo funciones específicas en la regulación génica para los dímeros individuales. Los miembros de la familia de AP-1 participan en el control de la proliferación celular, así como en diversos tipos de diferenciación, y también en la función neural y las respuestas al estrés. AP-1 es uno de los factores clave que traduce los estímulos externos en cambios de expresión génica tanto a corto plazo como a largo plazo.

El factor de transcripción c-Jun interactúa con factores de transcripción relacionados y no relacionados, ganando influencia sobre rutas de señales diferentes y aparentemente no relacionadas que controlan diversos genes diana. c-Jun recibe el input regulador originado en el exterior de la célula, atravesando la membrana plasmática, el citoplasma y la cubierta nuclear en una cascada de reacciones bioquímicas (Herrlich y Ponta, 1989; Ransone y Verma, 1990; Karin y Smeal, 1992) . Estas señales pueden modificar la transcripción del gen c-Jun o afectar a la actividad de la proteína c-Jun post-traduccionalmente. La regulación del potencial de transactivación de c-Jun tiene lugar a dos niveles diferentes: la fosforilación incrementada del dominio de transactivación causa un incremento de la actividad transripcional, y el incremento de la unión al ADN se debe a la desfosforilaciónde la región de unión al ADN (SAchsenmaier y Radler-Pohl, 1994) . Las células de mamífero no estimuladas contienen cantidades bajas, aunque detectables, de proteína c-Jun. En este estado, c-Jun se fosforila constitutivamente en las serinas y treoninas próximas a su dominio C-terminal de unión al ADN. La fosforilación en esta región reduce marcadamente la unión al ADN y la capacidad de transactivación de c-Jun in vitro (Boyleet al., 199) e in vivo (Linet al., 1992) . En contraste con el efecto negativo de la hiperfosforilaciónsobre la unión del ADN, el incremento de la fosforilación en el extremo N-terminal resulta necesario para la activación de la función de transactivación de c-Jun. Las serinas 73 y 63 se localizan en una posición próxima a un tramo de aminoácidos descrito como la "región rica en prolinas", que resulta necesaria para la transactivación y que puede servir como sustrato in vitro para las proteínas quinasa activadas por mitógenos (MAP) (Pulvereret al., 1991) . La regulación transcripcional por parte de c-Jun es altamente dependiente del tipo celular (Imleret al., 1988; Bohmann y Tjian, 1989; Baichwald y Tjian, 1990) debido a los diferentes activadores situados cadena arriba, moléculas asociadas o dianas situadas cadena abajo y presentes en los diferentes tipos celulares. Se ha propuesto un papel funcional para c-Jun en la piel en la diferenciación y la carcinogénesis. Debido a que los ratones con inactivación de c-Jun no son viables (Johnson et al., 1993; Hilberget al., 1993) , sólo han podido investigarse las consecuencias de la falta de c-Jun durante el desarrollo y para la carcinogénesis de la piel mediante la generación de ratones con inactivación condicional de c-Jun (c-JunΔep) (Zenz

R. et al., 2003; Li et al., 2003) . Los ratones que no presentan c-Jun en los queratinocitos (c-JunΔep) desarrollan una piel normal pero expresan niveles reducidos de EGFR en los parpados, conduciendo a que nazcan con los ojos abiertos, tal como se observa en los ratones con mutación de anulación de EGFR. Los queratinocitos primarios de ratones c-JunΔep proliferan mal, muestran una diferenciación incrementada y forman haces de actina cortical prominentes, muy probablemente debido a la menor expresión de EGFR y su ligando HB-EGF. En ausencia de c-Jun, los ratones transgénicos K5-SOS-F con tendencia a la tumoración desarrollan papilomas de menor tamaño, con una expresión reducida de EGFR en los queratinocitos basales. De esta manera, mediante la utilización de tres sistemas experimentales los presentes inventores demostraron que EGFR y HB-EGF se encuentran regulados por c-Jun, que controla el desarrollo de los párpados, la proliferación de los queratinocitos y la formación de tumores en la piel.

Todas las proteínas Jun (c-Jun, JunB y JunD) son similares con respecto a su estructura primaria y su especificidad de unión al ADN. Sin embargo, JunB, debido a un pequeño número de cambios de aminoácidos en su región básica de cremallera de leucinas muestra una actividad de unión al ADN 10 veces más débil y una propiedad de homodimerización reducida en comparación con c-Jun.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Ratón deficiente en c-Jun y JunB en los queratinocitos debido a la deleción de los genes c-Jun y JunB en los queratinocitos.

2. Ratón según la reivindicación 1, en el que la deleción de los genes c-Jun y JunB se ha inducido mediante la expresión de un enzima de recombinación inducible en los queratinocitos.

3. Ratón según la reivindicación 1 ó 2, en el que la deleción de los genes c-Jun y JunB en losqueratinocitosestá mediada por un enzima de recombinación (recombinasa) específico de sitio inducible cuya síntesis se encuentra bajo el control transcripcional de un promotor específico de los queratinocitos, y que actúa sobre sitios de reconocimiento específicos flanqueantes de los genes c-Jun y JunB en el genoma.

4. Método de obtención del ratón según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un ratón transgénico que presenta los genes c-Jun y JunB flanqueados por sitios de reconocimiento para un enzima de recombinación específico de sitio inducible se cruza con un ratón transgénico que expresa dicho enzima de recombinación inducible bajo el control transcripcional de un promotor específico de los queratinocitos y en el que la actividad de recombinación de dicho enzima de recombinación se induce posteriormente, resultando en la deleción de dichos genes en los queratinocitos.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el enzima de recombinación inducible es la recombinasaCre fusionada con el receptor de estrógenos, y en el que la expresión de dicho enzima de recombinación inducible se encuentra bajo el control transcripcional de un promotor específico de los queratinocitos.

6. Método según la reivindicación 5, en el que los sitios de reconocimiento son sitios loxP y el enzima recombinasa es la recombinasaCre, que se encuentra fusionada con el receptor de estrógenos, bajo el control de un promotor específico de los queratinocitos, y en el que la deleción específica de los queratinocitos de los genes c-Jun y JunB se induce mediante la aplicación de un antiestrógeno.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el antiestrógeno se aplica mediante inyección intraperitoneal o la aplicación tópica.

8. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el que el antiestrógeno es el tamoxifeno.

9. Queratinocitos deficientes en c-Jun y JunB debido a la deleción de los genes c-Jun y JunB, derivados a partir del ratón según las reivindicaciones 1 a 3.

10. Ratón según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como modelo animal para la soriasis y la artritis soriática en el ser humano.


 

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