Un anticuerpo que se une de manera específica a un polipéptido 4Ig-B7-H3 y que bloquea una interacción entre un polipéptido 4Ig-B7-H3 y una célula NK para el uso en el tratamiento de un paciente con un tumor.

Métodos terapéuticos y de diagnóstico y composiciones para determinar 4Ig-B7-H3 y su receptor homólogo en las células NK

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se refiere a la identificación de la proteína 4Ig-B7-H3 como una molécula asociada a tumores que confiere protección hacia la lisis mediada por células NK a través de un receptor de 4Ig-B7-H3 en las células NK. La descripción proporciona compuestos que interfieren con las interacciones entre la proteína 4Ig-B7-H3 y su receptor, que se pueden usar para potenciar la citotoxicidad de las células NK. También se proporcionan compuestos que se unen a las células que expresan 4Ig-B7-H3 para inhibirlas o eliminarlas. Los compuestos son especialmente útiles en el tratamiento de tumores, afecciones inflamatorias, infecciones y transplante. También se proporcionan métodos para diagnosticar una enfermedad detectando una proteína 4Ig-B7-H3.

ANTECEDENTES

Las células citotóxicas naturales (NK) son una subpoblación de linfocitos que están implicados en la inmunidad no convencional. Las características y propiedades biológicas de las células NK incluyen la expresión de antígenos de superficie tales como CD16, CD56, y/o CD57, y la ausencia del complejo TCR alfa/beta o gamma/delta expresado en la superficie de la célula; la capacidad de unirse y destruir células que no expresan antígenos MHC/HLA "propios" mediante la activación de enzimas citolíticas específicas; la capacidad de destruir células tumorales u otras células enfermas que expresan un ligando de un receptor activante de NK; y la capacidad de liberar moléculas proteicas denominadas citocinas que estimulan o inhiben la respuesta inmunitaria.

La actividad de las células NK está regulada mediante un mecanismo complejo que implica señales tanto activantes como inhibitorias. Se han identificado varias clases diferentes de receptores específicos de NK que desempeñan un papel importante en el reconocimiento y la destrucción mediada por células NK de células objetivo deficientes de HLA de clase I. Una clase de receptores, los NCRs (receptores de citotoxicidad natural) , incluye NKp30, NKp46 y NKp44, todos miembros de la superfamilia Ig. Su entrecruzamiento, inducido mediante mAbs específicos, activa intensamente a las células NK, lo que da como resultado niveles de Ca++ intracelulares incrementados, que desencadena la citotoxicidad y la liberación de linfocinas.

Las células NK están reguladas negativamente por receptores inhibitorios específicos de la clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) . Estos receptores específicos se unen a determinantes polimórficos de las moléculas del MHC de clase I o HLA presentes en otras células e inhiben la lisis celular por NK. En seres humanos, ciertos miembros de una familia de receptores denominados receptores similares a Ig citotóxicos (KIRs) reconocen grupos de alelos de HLA de clase I.

Se ha demostrado que la población de células NK o clones que no coinciden en KIR, es decir, la población de células NK que expresan KIR que no son compatibles con las moléculas HLA de un hospedador, son los mediadores más probables del efecto anti-leucemia de injertos observado en el trasplante alogénico (Ruggeri, L., et al, Science 295, 2097-2100) . Una manera de reproducir este efecto en un individuo dado sería usar reactivos que bloqueen las interacciones entre los receptores inhibitorios de las células NK y sus ligandos que confieren una protección hacia la lisis mediada por las células NK. Por lo tanto, serían de gran valor las aproximaciones prácticas y eficaces en la modulación de la actividad de las células NK. Tal aproximación seria útil en el tratamiento de una amplia diversidad de enfermedades.

Ciertas enfermedades proliferativas, tales como los cánceres, carecen de un tratamiento eficaz. Los neuroblastomas, carcinomas y melanomas son ejemplos especialmente notables de tales cánceres. El neuroblastoma tiene un pronóstico especialmente malo. El neuroblastoma, el tumor sólido más habitual en la infancia, puede surgir en cualquier lugar a lo largo del sistema nervioso simpático (Brodeur, G. M. Neuroblastoma. (2003) Nat Rev Cancer. 3, 203-216; Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., y Berthold, F. (2003) Lancet Oncol. 4, 472-480) . Con frecuencia, el tumor primario se localiza en el abdomen, y la glándula suprarrenal es el lugar más habitual. La edad de 1 año representa un umbral de pronóstico importante. Por debajo de una edad de 1 año la mayoría de los tumores están localizados (etapas 1-2) o, si están diseminados, experimentan una maduración hasta ganglioneuromas benignos o retroceden espontáneamente (el denominado estadio 4S) . Al contrario, la mayoría de los niños de una edad superior a 1 año presentan una enfermedad muy diseminada en el momento del diagnóstico con metástasis que implica la médula ósea (MO) , cerebro, hígado y piel (estadio 4) y un pronóstico muy malo. De hecho, el neuroblastoma es el tumor con el riesgo de muerte más elevado en niños. En particular, debido a la resistencia a los fármacos o recidiva tras la terapia convencional, los niños en la etapa 4 tienen tasas de supervivencia muy bajas (probabilidad de supervivencia de 3 años < 15%) . Uno de los objetivos de la investigación actual es mejorar la comprensión del comportamiento biológico del neuroblastoma, e identificar marcadores nuevos que se usarían para el diagnóstico, la monitorización de la enfermedad y también para intentar aproximaciones terapéuticas innovadoras. En particular, la caracterización de las moléculas superficiales expresadas por las células de neuroblastoma permitiría una identificación y cuantificación más precisa de las células tumorales, en particular en la MO, un sitio frecuente de recidivas tumorales. Esto mejorará el diagnóstico y permitirá definir mejor el grado de riesgo en un paciente particular, así como administrar la terapia más adecuada. En este contexto, se usa en general el disialogangliósido GD2 como marcador asociado a neuroblastoma (Schulz, G., Cheresh, D. A., Varki, N. M., Yu, A., Staffileno, L. K., y Reisfeld R. A. (1984) Cancer Res. 44, 5914-5920; Hakomori, S. (1984) Annu. Rev. Immunol. 2, 103-126) . Sin embargo, los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-GD2 también reaccionan con células distintas de las células tumorales. Una explicación concebible es que el GD2 recortado de la superficie celular de neuroblastoma se puede unir a la superficie de otras células y reaccionar con el mAb específico anti-GD2 (Ladish, S., Wu, Z. L, Feig, S., Schwartz, E., Floutsis, G., Wiley, F., Lenarsky, C., y Seeger, R. (1987) Int. J. Cancer. 39, 73-76; Valentino, L., Moss, T., Olson, E., Wang, H. J., Elashoff, R., y Ladisch, S. (1990) Blood 75, 1564-1567) . La identificación de antígenos superficiales nuevos expresados por el neuroblastoma permitiría también aislar de manera selectiva las células tumorales recientes, en las que se podría estudiar su susceptibilidad hacia la lisis mediada por NK. De hecho, se ha demostrado que las líneas celulares de neuroblastoma cultivadas in vitro son susceptibles hacia la lisis mediada por NK (Sivori, S., Parolini, S., Marcenaro, E., Castriconi, R., Pende, D., Millo, R., y Moretta, A. (2000) J. Neuroimmunol. 107:220-225) . Existe, por lo tanto, la necesidad en la técnica de antígenos superficiales nuevos expresados en las células cancerosas.

Las proteínas B7H3 se han descrito recientemente. El documento W01/94413 describe una proteína 4Ig-B7-H3 como un receptor activante en las células T, y expone que los anticuerpos hacia esta proteína proporcionarán inmunosupresión.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

El alcance de la presente invención se define mediante las reivindicaciones, y cualquier información que no se halle dentro de las reivindicaciones se proporciona como información únicamente.

El objetivo del presente estudio fue identificar marcadores superficiales nuevos que permitirían una detección precisa de las células de neuroblastoma. Gracias a la generación de mAbs nuevos, los inventores identificaron la molécula 4Ig-B7-H3 (Sun, M., Richards, S., Prasad, D. V., Mai, X. M., Rudensky, A, y Dong, C. (2002) J. Immunol. 168, 62946297; Steinberger, P., Majidic, O., Derdak, S. V., Pfistershammer, K., Kirchberger, S., Klauser, C., Zlabinger, G., Pickl, W. F., Stockl, J. y Knapp, W. (2004) J. Immunol. 172, 2352-2359) como un antígeno de superficie valioso para la detección de células de neuroblastoma, en particular en aspirados de MO, así como de otras células cancerosas. Quizá de manera más importante, los inventores proporcionan pruebas... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que se une de manera específica a un polipéptido 4Ig-B7-H3 y que bloquea una interacción entre un polipéptido 4Ig-B7-H3 y una célula NK para el uso en el tratamiento de un paciente con un tumor.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que el polipéptido 4Ig-B7-H3 se expresa en las células tumorales extraídas de dicho paciente.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo es capaz de inducir la destrucción o la lisis de una célula a la que se une.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que el anticuerpo neutraliza el efecto protector del polipéptido 4Ig-B7-H3 hacia la célula en proliferación.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso definido en dichas reivindicaciones, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo tiene una porción Fc de IgG2 o IgG4.

7. El anticuerpo de la reivindicación 5 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo comprende una región Fc capaz de interaccionar con CD16 de una célula NK.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo tiene una porción Fc de IgG1 o IgG3 humana.

9. El anticuerpo de la reivindicación 7 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo comprende una o más modificaciones en la región Fc que potencia la afinidad del anticuerpo por un FcyR activante respecto del anticuerpo que comprende una región Fc de tipo natural.

10. El anticuerpo de la reivindicación 7 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo está sustancialmente exento de uno o más residuos de ácido siálico, uno o más residuos de galactosa y/o uno o más residuos de fucosa.

11. El anticuerpo de la reivindicación 7 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo no está fucosilado sustancialmente.

12. El anticuerpo de la reivindicación 7 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo se prepara: (a) mediante el uso de una célula hospedadora modificada que es deficiente del metabolismo de fucosa, de forma que tiene una capacidad reducida de fucosilar las proteínas expresadas en ella; (b) cultivando las células en condiciones que impiden o reducen la fucosilación; (c) mediante la eliminación post-traduccional de fucosa; o (d) mediante la purificación del anticuerpo para seleccionar el producto que no está fucosilado.

13. El anticuerpo de la reivindicación 1 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo está unido directamente a un agente citotóxico.

14. El anticuerpo de la reivindicación 13 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un isótopo radiactivo, un polipéptido tóxico, y una molécula pequeña tóxica.

15. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-14 para el uso definido en dichas reivindicaciones, en el que dicho anticuerpo se administra en combinación con un anticuerpo que inhibe la actividad de un receptor CD94/NKG2A o un receptor KIR inhibitorio.

16. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-14 para el uso definido en dichas reivindicaciones, en el que dicho anticuerpo se administra en combinación con un anticuerpo capaz de inducir la lisis de una célula objetivo a la que se une por medio de un mecanismo de ADCC.

17. El anticuerpo de la reivindicación 16 para el uso definido en dicha reivindicación, en el que dicho anticuerpo capaz de inducir la lisis de una célula objetivo a la que se une por medio de un mecanismo de ADCC es un anticuerpo que se une a CD16 por medio de su región Fc.

18. Un método para determinar si un individuo que alberga una célula particular tiene o es susceptible de tener un tumor o cáncer que se puede beneficiar de la administración de un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-17, y el método comprende detectar in vitro la expresión de un polipéptido 4Ig-B7-H3 por una célula de una muestra tumoral de dicho individuo, en el que una determinación de que dicha célula expresa un polipéptido 4Ig-B7-H3 indica que un individuo que alberga dicha célula tiene o es susceptible de tener un tumor o cáncer y se puede beneficiar de la administración de un anticuerpo de las reivindicaciones 1-17.

19. El método de la reivindicación 18, en el que la etapa de detectar in vitro la expresión de un polipéptido 4Ig-B7-H3 por una célula comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo hacia un polipéptido 4Ig-B7-H3, y detectar la unión del anticuerpo a la célula.

20. Un método para seleccionar un anticuerpo adecuado para el uso en el tratamiento de un tumor, y dicho método

comprende: i) proporcionar uno o una diversidad de anticuerpos que se unen de manera específica a un polipéptido 4Ig-B7-H3; ii) ensayar la capacidad de cada uno de los anticuerpos de bloquear una interacción entre un polipéptido 4Ig-B7-H3 y una célula NK; y iii) seleccionar un anticuerpo de la diversidad que bloquea dicha interacción.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18-20 o el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 117, en el que el tumor es un neuroblastoma.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18-20 o el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 117, en el que el tumor es un melanoma.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18-20 o el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 117, en el que el tumor es un carcinoma.

FIG 7

Células Histotipo mAb 5B14 mAb GD2

Células NK en reposo --Células NK activadas --Células T en reposo --Blastos PHA --Células B en reposo --Granulocitos --Monocitos +/--IDC ++ -

mDC ++ -YT Línea de células NK -++ NK92 Línea de células NK --CEMB Leucemia T --Jurkat Leucemia T -+/-H9 Leucemia T -+/-HSB2 Leucemia T Rail Linfoma de Burkitt --LCL 721.221 Línea celular de EBV --EA Células endoteliales ++ -K562 Eritroleucemia + -MM6 Leucemia promielocítica + -U937 Leucemia mieloide + -293T Fibroblastos embrionarios ++ -M14 Melanoma ++ -FO-1 Melanoma ++ ++ Me 1074 Melanoma ++ ++ H460 Carcinoma de pulmón ++ -SMMC Hepatoma ++ -HELA Carcinoma de cuello uterino ++ -IGROV-1 Carcinoma ovárico ++ -SKNEP Carcinoma de riñón + -A172 Glioblastoma ++ -HT29 Carcinoma de colon ++ -CX2 Carcinoma de colon ++ -SKBr3 Carcinoma de mama + -MDAM B453 Carcinoma de mama +/--