Anticuerpos anti-KIR3D.

Un anticuerpo aislado que se une de forma específica a un epítopo dentro del dominio 0 de KIR3DL2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:

21, en el que dicho anticuerpo inhibe la proliferación de linfocitos T CD4+ humanos que expresan KIR3DL en ausencia de células efectoras y comprende una región constante del isotipo de IgG humana.

Anticuerpos anti-KIR3D

Campo de la invención La presente divulgación proporciona proteínas de unión a antígeno capaces de unirse a polipéptidos KIR3DL2. Los anticuerpos presentan un aumento de la actividad en el tratamiento de trastornos caracterizados por células que expresan KIR3DL, en particular linfocitos T CD4+, incluyendo neoplasias tales como Micosis fungoide y Síndrome de Sézar y .

Antecedentes Los receptores linfocíticos de tipo inmunoglobulina (KIR) son una familia de receptores que, junto con los receptores de lectina de C (CD94-NKG2) , son usados por subconjuntos de linfocitos NK y linfocitos T para reconocer de forma específica moléculas de clase I de MHC. Ciertos KIR inhibitorias y de activación tienen dominios extracelulares altamente similares y son reconocidos por el mismo anticuerpo monoclonal, por ejemplo tanto KIR2DL1 como KIR2DS1 son reconocidos por EB6, y 2DL2 y 2DS2 por GL183. Se han usado tres criterios (número de dominios extracelulares de tipo Ig (dominios D0, D1, D2) , longitud de la cola citoplasmática, y analogía de secuencias) para clasificar las proteínas KIR en 13 grupos, en particular KIR3DL1-2, KIR3DS1, KIR2DL1-5, y KIR2DS1-5. La nomenclatura 2D para 2 dominios o 3D para 3 dominios proporciona el número de dominios de tipo Ig; los receptores con cualquier dominio citoplasmático largo o corto se clasifican adicionalmente como L o S. (Pascal V. et al., 2007 J. Immunol. 179: 1625-1633) . Los receptores inhibitorias poseen colas citoplasmáticas largas (L) (es decir, KIR2DL o KIR3DL) que contienen un ITIM canónico que se fosforila con tirosina después del acoplamiento de KIR de sus ligando los de clase I de HLA. El ITIM fosforilado recluta el dominio de homología 2 de Src que contiene fosfatasa 1 del dominio 2 de homología de Src de proteínas tirosina fosfatasas y/o fosfatasa 2 que contiene dominio de homología 2 de Src, que desfosforilan sustratos celulares, abortando de este modo la señal de activación de NK, es decir, moderando las células diana con expresión de clase I apropiada de auto-MHC. Los receptores con colas citoplasmáticas cortas (S) carecen de los ITIM (es decir, KIR2DS o KIR3DS) . Estos KIR de activación contienen un resto cargado con sus dominios de transmembrana facilitando la interacción con la cadena KARAP/DAP12 de señalización. Se ha mostrado que el acoplamiento de la familia KIR2DS de receptores conduce a una cascada de sucesos de señalización mediados por KARAP/DAP12 que culminan con el aumento de la actividad citolítica de los linfocitos NK y la producción de citoquinas proinflamatorias tales como IFN- (Pascal et al. 2007) J. Immunol. 179: 1625-1633) . Se predice que los linfocitos NK maduros adquieren al menos un receptor inhibitorio específico para una molécula de clase I auto-MHC específica, que generalmente prevalece de forma funcional sobre moléculas de activación potencialmente autorreactivas. Se propone que la respuesta de los linfocitos NK representa el resultado integrado de la señalización tanto de activación como inhibitoria por KIR y otros receptores.

El análisis de cristalografía por rayos X ha proporcionado imágenes de alta resolución de KIR2DL2 unido a HLA-Cw3 y de KIR2DL1 unido a HLA-Cw4 (Boyington, et al. (2000) Nature. 405: 537-543) . En ambos complejos, se ven implicados bucles de los dominios D1 y D2 de tipo Ig de KIR2D en la unión a moléculas de HLA. En comparación con las interacciones de KIR2D con HLA-C, se sabe poco de la interacción entre KIR3D y sus ligandos HLA-B o HLA-A. Los genes de KIR2D que codifican receptores HLA-C forman parte de un grupo más grande de KIR denominado KIR del linaje III y todos los genes de KIR2D del linaje III contienen un pseudoexón que codifica un dominio D0 que no se incorpora en el ARN maduro. Por lo tanto, se cree que los genes de KIR2D han evolucionado a partir de genes de KIR3D. El KIR humano específico para HLA-A y B forma parte del linaje II de KIR que está formado únicamente por KIR3D y todos comprenden un dominio D0. El dominio D0 es el dominio de tipo Ig más Nterminal en proteínas KIR3D. Aunque algunos informes sugieren que el dominio D0 no está implicado en la señalización inducida por ligandos (por ejemplo, Sny der et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 3864-3869, otros han propuesto modelos en los que el dominio D0 no participa en la unión a ligandos y puede tener un aumento de su función en la señalización. Khakoo et al., (2002) (J. Exp. Med. 196 (7) :9 11-921) informaron que diversas mutaciones puntuales en los dominios D1 y D2 de KIR3DL1, pero ninguna de 15 mutaciones puntuales en D0, anulaban la unión de KIR3DL1 a Bw4+ HLA-B.

Se informado que varias neoplasias, trastornos autoinmunes o inflamatorios implican a los linfocitos T CD4+ que expresan receptores KIR3D. Sin embargo, el papel funcional de KIR en los linfocitos T es muy desconocido, y sea informado de la señalización mediada por KIR solamente en linfocitos T CD8+ y NK, en cuyo caso KIR se ha visto implicado en la regulación de la citotoxicidad de células efectoras. El escaso conocimiento de la señalización de KIR en los linfocitos T CD4+ se ha limitado a KIR activadores (por ejemplo, polipéptidos KIRDS) , y se ha informado que éstos solamente tienen un papel coactivador, en lugar del papel activador real en linfocitos NK (véase, por ejemplo Namekawa 2000, mencionado anteriormente) . Se informó que la falta de función activadora real para KIRDS era debida a la falta de adaptadores de señalización "DAP12" en linfocitos T (Sny der et al. (2003) J. Exp. Med. 197 (4) : 437-49) .

En la bibliografía científica se ha informado de la existencia de numerosos anticuerpos anti-KIR. Shin et al. (1999) Hibridoma 18 (6) : 521-527, por ejemplo, informan de un estudio de anticuerpos KIR. La mayoría de los anticuerpos 2 15

que se unen a KIR no parece que inhiban la transducción de la señal mediada por el KIR y por lo tanto no eran funcionales. Watzl C. et al., (2000) Tissue Antigens; 56: 240-247, identificaron anticuerpos "Lig1" que se unían a un epítopo común en receptores KIR2D, (excepto para KIR2DL4) pero que no se unían a ningún polipéptido KIR3D. Sin embargo, los anticuerpos de Watzl et al. no eran funcionales en su capacidad para bloquear la inhibición mediada por ligando de KIR de la citotoxicidad de linfocitos NK, ni inhibían la unión de proteínas de fusión de KIR-Ig a células que expresan la clase I de MHC. Otras publicaciones mencionan la existencia de anticuerpos reactivos frente a diversos polipéptidos KIR3D. No se informa de que ninguno de estos anticuerpos distinga polipéptidos KIR3D de polipéptidos KIR2D mediante la unión de todos los KIR3D (es decir KIR3DL1, KIR3DL2 y KIR3DS1) incluso ningún polipéptido KIR2D. Se ha informado de dos anticuerpos anti-KIR3DL2: Q241 y Q66 (Pende, et al. (1996) J Exp Med 184: 505-518) . Estos anticuerpos son del isotipo IgM y se esperara que tengan baja actividad de ADCC, o si sus regiones variables se colocaran en el contexto de un anticuerpo de tipo IgG bivalente, por lo general su afinidad disminuiría hasta el punto de que se podría descartar una inducción significativa de ADCC. Se informó de la existencia de un anticuerpo KIR3DL2 adicional mencionado solamente con el nombre de las células "AZ158" que lo producen (Parolini, S., et al. (2002) In Leucocyte typing VII. D. Mason, editor. Oxford University Press, Oxford. 415417) . Se ha informado que varios anticuerpos se unen al KIR3DL1 monomérico pero no al p140-KIR3DL2 dimérico (por ejemplo, el clon Z27 del grupo A. Moretta y DX9 del grupo L. Lanier, ambos disponibles en Becton Dickinson) . Mientras que KIR3DL1 y KIR3DS1 comparten una identidad de secuencias elevada (KIR3DS1 es una forma de activación del gen KIRDL1) , KIR3DL2 y KIR3DL1 difieren en que KIR3DL2 son diméricos y comparten una identidad de aminoácidos menor con KIR3DL1, incluyendo dentro del ECD (identidad de un 86 %) . KIR3DL1 reconoce las moléculas HLA-B de clase I de MHC mientras que KIR3DL2 reconoce HLA-A.

A pesar de las numerosas investigaciones en la familia KIR, y a pesar de la existencia de reactivos de investigación que se unen a diversos KIR, el papel de ciertos KIR tal es como los polipéptidos KIR3D sigue sin elucidar. Por lo tanto, existe una necesidad de mejorar las terapias basadas en anti-KIR.

Sumario de la invención El alcance de la presente invención se define con las reivindicaciones y cualquier información que no entre dentro de reivindicaciones se proporciona tan solo de manera informativa.

La presente divulgación e el resultado, entre otros, del descubrimiento de anticuerpos que se unen al dominio D0 de polipéptidos KIR3D. El dominio D0 se sitúa en los restos de aminoácidos 22 a 145, con referencial polipéptido KIR3DL2 de la SEC ID Nº: 4. Además, se observó que el... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que se une de forma específica a un epítopo dentro del dominio 0 de KIR3DL2 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 21, en el que dicho anticuerpo inhibe la proliferación de linfocitos T CD4+ humanos que expresan KIR3DL en ausencia de células efectoras y comprende una región constante del isotipo de IgG humana.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho epítopo es un determinante común compartido por los polipéptidos KIR3DL1 y KIR3DL2.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 a 2, en el que dicho anticuerpo comprende un dominio de Fc modificado.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que dicho dominio de Fc modificado está hipofucosilado.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo compite por la unión a KIR3DL2 con el anticuerpo bivalente que comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº: 8 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 10.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es bivalente.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR de las SEC ID Nºs: 11 a 13 y una cadena ligera que comprende las tres CDR de las SEC ID Nºs: 14 a 16.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

9. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 fusionada con una región constante de cadena de IgG1 humana; y

(b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 fusionada con una región constante de cadena kappa humana.

10. Una composición de anticuerpo que comprende una pluralidad de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que al menos un 40 % de los anticuerpos tiene una estructura que oligosacárido unido a N de un tipo biantenario que comprende cadenas largas con GlcNac terminal que están altamente galactosiladas y no fucosiladas.

11. Una célula hospedadora recombinante que produce un anticuerpo de la reivindicación 1.

12. La célula hospedadora de la reivindicación 11, en la que la célula es una línea de células madre derivada de embriones aviares.

13. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10; y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición de la reivindicación 13, para uso como un medicamento para modular la actividad de linfocitos T en un paciente que padece un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio o una neoplasia de linfocitos T.

15. La composición para uso de la reivindicación 14, en la que dicho trastorno se selecciona entre el grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, espondiloartritis, Síndrome de Sézar y y Micosis fungoide.