Método para la selección de células neuronales en función de su diferenciación mediante exposición a flubendiamida.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la selección de células neuronales en cultivo en función de su diferenciación,

a través del establecimiento de una relación dosis-respuesta mediante la adición de distintas concentraciones de flubendiamida a varios grupos de células neuronales. De aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de la población de células neuronales en diferenciación para fines investigadores y/o terapéuticos, como por ejemplo en la investigación sobre el efecto de factores o sustancias del ámbito medioambiental, agroalimentario, químico, farmacéutico, etc, y en terapias antitumorales o neuro-regenerativas.

MÉTODO PARA LA SELECCIÓN DE CÉLULAS NEURONALES EN FUNCIÓN DE SU DIFERENCIACIÓN MEDIANTE EXPOSICIÓN A FLUBENDIAMIDA

La presente invención se refiere a un método para la selección de células neuronales en función de su nivel de diferenciación.

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de la población de células neuronales en diferenciación para fines investigadores y/o terapéuticos, como por ejemplo en la

1 O investigación sobre el efecto de factores o sustancias del ámbito medioambiental, agroalimentario, químico, farmacéutico, etc., y en terapias antitumorales o neuroregenerativas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las células neuronales adultas representan el grado máximo de diferenciación celular. Durante el proceso de diferenciación, adquieren todas las propiedades que, oportunamente integradas, permiten el funcionamiento del sistema nervioso. El proceso de diferenciación neuronal es consecuentemente un momento crítico para el correcto funcionamiento del sistema nervioso y, particularmente en el ser humano,

para el desarrollo de sus facultades mentales. Fallos en la diferenciación neuronal durante el desarrollo embrionario humano conllevan importantes deficits cognitivos en la vida posnatal cuando ésta es posible, y fallos en la diferenciación neuronal de células madres del sistema nervioso central adulto pueden dar lugar a la formación de tumores particularmente agresivos e incapacitantes.

Existen múltiples técnicas para la selección de células en función de su grado de diferenciación. Cada técnica aprovecha metodologías diferentes (fisicas, biofisicas, químicas, farmacológicas, inmunológicas, etc.) asociadas con peculiares características génicas, bioquímicas, fisiológicas, que pueden satisfacer muchas necesidades experimentales. Sin embargo es laborioso y complejo aislar poblaciones

de células neuronales durante su desarrollo in vitro ya que se necesitan aparatos

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específicos, tales como un "cell-sorter", que no están siempre al alcance de todos los laboratorios, y esto obliga los investigadores de varios grupos a compartir los aparatos disponibles aumentando los problemas técnicos inherentes (limpieza, esterilidad, calibración, etc) y el tiempo necesario para conseguir la población neuronal deseada.

Además, esto se obtiene sólo en células neuronales que todavía no se hayan adherido a una superficie de cultivo y no hayan iniciado su desarrollo morfológico, bioquímico y fisiológico, de tal manera que no es posible aprovechar estos factores en la selección de las células neuronales .

1 O DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A los efectos de la presente invención y su descripción, la flubendiamida es 3iodo-N'- (2-mesil-1, 1-dimetiletil) -N-{ 4-[ 1 , 2, 2, 2-tetrafluoro-1- (trifluorometil) etil]-otolil} ftalimida.

El método objeto de la presente invención se basa en que la exposición a la

flubendiamida de una población de células nerviosas con distinto grado de diferenciación, induce la muerte de las células neuronales menos diferenciadas. Con este método es posible: 1) determinar el número de células nerviosas que consigue una diferenciación más rápida en respuesta a distintos tratamientos físicos, químicos y farmacológicos; 2) obtener cultivos neuronales más homogéneos en sus propiedades

fisiológicas; 3) reducir la variabilidad de la respuesta celular a la exposición a sustancias de interés fármaco-toxicológico; 4) seleccionar poblaciones neuronales resistentes a la flubendiamida para el estudio de los mecanismos de resistencia con el fin de aprovecharlos terapéuticamente.

La presente invención se refiere a un método para seleccionar células 25 neuronales en función de su grado de diferenciación que comprende los siguientes parámetros y etapas:

• Parámetros:

1) número de días del cultivo primario.

2) tiempo de exposición a flubendiamida.

3) concentraciones de flubendiamida.

..

• Etapas:

a) Establecimiento de 5 grupos (A, B, C, D, E) de células neuronales, en su primer, 2°, 4°, 6° y 8° día en cultivo respectivamente, donde cada grupo debe constar de no menos de 2 placas del mismo cultivo (A', A";

B' B"· C' C"· D' D"· E' E")

' ' ' ' ' ' ' .

b) Establecimiento de una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 ¡..tM, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que, siguiendo el esquema indicado en la Tabla I como ejemplo para el grupo A, se obtienen los grupos: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. hasta E, [20], 96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida.

e) Detección de los efectos citotóxicos inducidos por la flubendiamida en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos.

d) Identificación de la concentración de flubendiamida que produce el máximo efecto tóxico en relación a la edad de las células y al tiempo de exposición en cultivo, para su posterior utilización en la selección de poblaciones de células neuronales en cultivos destinados a la investigación.

Tabla 1: Ejemplo, para el grupo A, de organización de grupos en función del tiempo de exposición a la flubendiamida y la concentración de la misma.

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..

l. Procedimiento para la selección de células neuronales en cultivo en función de su diferenciación, que comprende las siguientes etapas:

a) establecimiento de 5 grupos (A, B, C, D, E) de células neuronales, en su 1 er, 2°, 4°, 6°, 8° día en cultivo respectivamente, donde cada grupo debe constar de no menos de 2 placas del mismo cultivo (A' A"· B' B"· C' C"· D' D"· E'

' ' ' ' ' ' ' ' '

E") ;

b) establecimiento de una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 J..LM, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que se obtienen los grupos: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. hasta E, [20], 96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida.

e) detección de los efectos citotóxicos inducidos por flubendiamida en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos;

d) identificación de la concentración de flubendiamida que produce el máximo efecto tóxico en relación a la edad de las células en cultivo y al tiempo de exposición para su posterior utilización en la selección de poblaciones de células neuronales en cultivos destinados a la investigación;

e) interrupción del tratamiento con flubendiamida en cultivos destinados a la investigación mediante lavado de las células previamente tratadas utilizando una solución fisiológica.

2. Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que las células neuronales son neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario.

3. Procedimiento, según reivindicación 2, caracterizado por que las neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario son neuronas granulares de cerebelo de rata.

4. Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase.

5. Procedimiento, según reivindicación 4, caracterizado por que la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia.

6. Procedimiento, según reivindicación 1, caracterizado por que el lavado de las