MÉTODO PARA EL PRONÓSTICO DE TUMORES DEL DESARROLLO Y USO DE INHIBIDORES DE LA METILACIÓN GÉNICA PARA EL TRATAMIENTO DE LOS MISMOS.

Método para el pronóstico de tumores del desarrollo y uso de inhibidores de la metilación génica para el tratamiento de los mismos.

La presente invención pertenece al campo del pronóstico y la terapia de tumores pediátricos o del desarrollo. En concreto, se refiere a un método para establecer el pronóstico de los tumores del desarrollo basado en el análisis de los mecanismos de inactivación del gen del receptor sensor de calcio (CaR) que incluyen la determinación del estado de metilación de su promotor 2 y el análisis del estado alélico del locus del gen CaR, así como al uso de inhibidores de DNA metiltransferasas y de la desacetilación de las histonas para el tratamiento de los tumores pediátricos.

Métodoparaelpronósticode tumoresdel desarrolloyusode inhibidores de la metilacióngénicaparael tratamiento de los mismos.

Campo de la invención La presenteinvención perteneceal campo del pronósticoyla terapiade tumores pediátricoso del desarrollo.En concreto, se refiereaun métodopara establecerel pronósticodelos tumoresdel desarrollo basadoenel análisis de los mecanismosde inactivacióndelgendel receptor sensorde calcio (CaR) que incluyen la determinación del estado de metilación de su promotor2yel análisis del estado alélico del locus del gen CaR, así como al uso de inhibidores de DNAmetiltransferasasy dela desacetilaciónde las histonas parael tratamientode los tumores pediátricos.

Antecedentes de la invención Se conocen como tumores del desarrollo aquellos que se manifiestan principalmente durante la edad pediátrica o que únicamente se manifiestan en esta etapa. Por esta razónaveces se les denomina también como tumores pediátricos. En el contexto de la presente invención se usará indistintamente el término tumor deldesarrollo o tumor pediátrico.

Dentro del grupode los tumores del desarrollo estánlos neuroblastomas (NB) , losganglioneuroblastomas (GNB) yganglioneuromas (GN) que conforman a su vez el grupo de los tumores neuroblásticos (TN) .

LosTN son los tumores sólidosextracraneales más frecuentes de la infanciay se desarrollan a partirde células de la cresta neural ya comprometidas en la formación del sistema nervioso periférico, por lo que se localizan enla médula suprarrenalo en losganglios nerviosos de la cadena simpática paravertebral.Se tratade un grupode tumores muyheterogéneo desdeel puntode vistaclínico, anatomopatológico, genéticoybiológico (Brodeur GM. Neuroblastoma: biological insightsintoa clinicalenigma.NatRevCancer.2003;3 (3) :203-16) .Supresentación clínica incluye unvariado espectroque abarcalaregresiónespontánea, el crecimientoexclusivamente loco-regionalyla proliferación agresiva local acompañadade diseminación metastásica (AmbrosPF, et al. Regression and progression in neuroblastoma.EurJCancer1995; 31:510-15) .Losdos primeros grupos presentan índicesde supervivenciaexcelentes, perolos NB metastásicos, pesea ser sometidosa terapias intensivas multimodales, tienenaúnhoydía índicesde supervivencia no superiores al 30%. Los esfuerzos dirigidos en los últimos años a modificar los protocolos de tratamiento apenas han alterado estas cifras.

Las bases biológicas responsables de la diversidad clínica de losTN se conocen sólo parcialmente. Entre ellas, destacan las alteraciones de la ploidía, las translocaciones desequilibradas, las deleciones ogananciasde regiones cromosómicas recurrentesyla amplificación del oncogén MYCN (Ambros IM et al. Role of ploidy, chromosome 1p and Schwann cells in the maturation of NB.N EnglJ Med 1996; 334:1505-11. Brodeur GM, et al. Amplification of MYCN in untreated human neuroblastomas correlates with advanced disease stages. Science 1984; 224:1121-4; Bown N, et al. Gain of chromosome arm 17q and adverse outcome in patients with neuroblastoma.N EnglJ Med 1999; 340:1954-61) . Estas alteraciones genético-moleculares, aunque cruciales para el comportamiento biológico de los TN, apenas pueden ser modificadas terapéuticamente. Antes de que se describieran muchas de ellas, se sabía que los TN más diferenciadosy con mayor proporción de componente estromal tipo Schwann (NB en diferencia-ción, GNByGN) se asociaban a mejor pronósticoquelosNB indiferenciados.Sehan descubierto algunas de la s vías moleculares responsables de los procesos de diferenciación celular en TN. Estas rutas son de gran importancia terapéuticaya que son modulablesfarmacológicamente. Así, por ejemplo, el ácidoretinoico induce diferenciación en líneas celulares de NB (Pahlman S, et al. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differ. 1984; 14:135-144) y en los tumores de los pacientes, mejorando la supervivencia global de un subgrupo de ellos (Matthay KK, et al. Long-term results for children with high-risk neuroblastoma treated on a randomized trial of myeloablative therapyfollowed by 13-cis-retinoic acid.J ClinOncol. 2009; 27:1007-13) . Sin embargo, algunosNB son resistentesala acciónde este fármaco, perolafaltade un conocimiento detalladode los mecanismos moleculares responsables de la diferenciación de los TN dificulta el diseño de nuevos agentes diferenciadores que puedan beneficiar a un mayor número de pacientes.

El gen del receptor sensor de calcio (CaR) fue clonado en 1993 a partir de células paratiroideas bovinas (Brown EM, et al. Cloning and characterization of an extracellular Ca (2+) -sensing receptor from bovine parathyroid. Nature 1993; 366:575-80) yforma partedelafamiliaCdela superfamiliade receptores acopladosa proteínasG (GPCR) . Su principal función es detectar las fluctuaciones del Ca2+ extracelular y regular consecuentemente la secreción de hormona paratiroidea (PTH) en las glándulas paratiroidesy de calcitonina en las célulasC del tiroides, hormonas encargadas de normalizar la calcemia. CaR detecta también cambios extracelulares de otros cationes (Gd3+, Mg2+) , L-aminoácidosypoliaminas, entreotros (HuJ, SpiegelAM. Structureand functionofthe calcium-sensing receptor: insights from natural and engineered mutations and allosteric modulators.JCellMol Med 2007; 11:908-922) .

El gen humano CaR se localiza enla región cromosómica 3q13.3-21. Está compuesto por6 exones codificantesy dosexones1alternativosy no codificantes, 1Ay1B, bajoel control respectivamentedelos promotores1y2.

La proteína CaR se compone de un gran dominio extracelular, donde tiene lugar la interacción con el Ca2+, un dominio transmembrana de7 loops (característico de los GPCR) y una cola carboxilo-terminal intracitoplasmática (Hu J, Spiegel AM. Structure and function of the calcium-sensing receptor: insights from natural and engineered mutationsand allosteric modulators.JCellMolMed 2007; 11:908-922) . Este receptor, en formade homodímero, es capazde reclutar distintas proteínasG (Gq/11, G12/13yGi) , activando como consecuencia diferentes víasde señalización. Existen enfermedades causadas por mutaciones inactivadoras o activadoras de CaR. En el caso de las primeras, tanto en humanos como en ratones CaR -/-, se produce, además de sobreproduccción dePTH, hiperplasia de paratiroides, por lo que se cree que, en condiciones normales, CaRrestringe la proliferación de las células paratiroideas (Brown EM. Clinical lessons fromthe calcium-sensing receptor. Nat Clin Pract 2007; 3:122-133) .

CaR se halla expresado en otros órganos implicados en el metabolismo del Ca2+ (riñón, hueso, intestino) y en la piel, enlacualjuegaunpapel fundamentalparaquetengalugarladiferenciacióndelosqueratinocitos (TuCL, et al. Theextracellular calcium-sensing receptoris required for calcium-induced differentiationin humankeratinocytes. J Biol Chem. 2001; 276:41079-41085) . También se halla expresado en el sistema nervioso central y periférico, y la expresión de CaR se incrementa en células precursoras del sistema nervioso central cuando se diferencian hacia oligodendrocitos (equivalentes a las células de Schwann del sistema nervioso periférico) (Chattopadhyay N, et al. Calcium-sensing receptor expression and function in oligodendrocyte commitment and lineage progression: Potential impact on reduced myelin-basic proteinin CaR- mice.JNeurosci Res. 2008; 86:2159-2167) .

Seha hallado tambiénexpresióndeCaRen distintasneoplasias (revisadoen RodlandKD.The roleofthe calciumsensing receptor in cancer. Cell Calcium. 2004; 35 (3) :291-5) con la particularidad de que parece ejercer una función muy distinta dependiendo del contexto celular en el que se halla. Así, por ejemplo, la activación de CaR promueve proliferaciónymetástasis en carcinomade próstata (LiaoJ, et al. Extracellular calcium as a candidate mediator of prostate cancer skeletal metástasis. Cancer Res. 2006; 66: 9065-73) , mientras que participa en los procesos de diferenciación en carcinoma de colon (Chakrabarty S, et al. Extracellular calcium and calcium-sensing receptor function in human colon carcinomas: promotionof E-cadherinexpressionand suppressionof beta-catenin/TCF activation. Cancer Res. 2003; 63: 67-71) .

Los autores de la presenteinvencióndescribieron (deTorresC, et al. The calcium-sensingreceptor and parathyroid hormone-related protein areexpressedin differentiated, favorable neuroblastic tumors. Cancer 2009; 115 (12) :2792803) una nueva vía molecular involucrada en la diferenciación de los TN en la que participan CaR y PTHrP. En concreto, describieron por primera... [Seguir leyendo]

1. Método para el pronóstico de tumores del desarrollo en un paciente que padece un tumor del desarrollo que comprende la determinación del estado de metilación del promotor2del gen CaR en muestras de tumor del paciente dondela hipermetilaciónde dicho promotor2delgen CaR indica que el tumor tiene un mal pronóstico.

2. Método de acuerdo con la reivindicación1 donde la determinación del estado de metilación del promotor2 del gen CaR se realiza por PCR específica de bisulfito, por PCR específica de metilación y/o por análisis combinado bisulfito restricción.

3. Métodode acuerdo conla reivindicación2dondela determinación del estadode metilación del promotor2del gen CaR por PCR específica de bisulfito comprende:

a) Extracción del ADNde lasmuestras tumoralesytratamiento con bisulfitode dicho ADN

b) AmplificacióndelADNdelaetapaa) conlosparesde cebadoresSEQIDNO1/SEQIDNO2parala amplificación del fragmento BSP-1de la isla CpG del gen CaR, SEQ ID NO 3/SEQ ID NO4para la amplificacióndel fragmentoBSP-2delaislaCpGdelgenCaR, ySEQIDNO5/SEQIDNO6parala amplificación del fragmento BSP-3 de la isla CpG del gen CaR

c) Secuenciación de los fragmentos amplificados en b) , d) Identificación en las secuencias amplificadas de aquellas timinas que no estén presentes en la secuencia génica del tumor analizado antes del tratamiento con bisulfito, donde dichas timinas en las secuencias amplificadas se corresponden con citosinas no metiladas en la secuencia génica de la muestra del tumor analizada.

e) Cálculo del porcentaje de metilación del promotor2 del gen CaR donde un porcentaje de metilación superioral6% implica hipermetilaciónymal pronostico del tumor.

4. Métodode acuerdo conla reivindicación2dondela determinación del estadode metilación del promotor2del gen CaR por PCR específica de metilación comprende:

a) Extracción del ADNde lasmuestras tumoralesytratamiento con bisulfitode dicho ADN

b) amplificación del ADN de la etapa a) con los pares de cebadores SEQ ID NO 9/SEQ ID NO 10 para amplificarlos alelosno metiladosySEQIDNO11/SEQIDNO12para amplificarlos alelos metilados, c) Sometera electroforesislos productos amplificados enla etapab)

d) Visualizacióndelosproductosdeamplificación dondela presenciade productode amplificaciónparael ADN amplificado con los pares de cebadores SEQ ID NO 11/SEQ ID NO 12 implica la hipermetilación del promotor2del gen CaR.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde los tumores del desarrollo se seleccionan entre los tumores neuroblásticos como neuroblastomas, ganglioneuroblastomasoganglioneuromas, sarcomas de Ewing, rabdomiosarcomas alveolaresyembrionarios, osteosarcomas, sarcomas sinoviales, fibrosarcomas, miofibromatosisy otros tumores fibro-histiocitarios, tumores del sistema nervioso central como gliomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, gangliogliomas o xantoastrocitomas, tumores de Wilms y otros tumores renales, histiocitosis, schwanomas, neurofibromas, neurofibrosarcomas, leucemias, linfomas, teratomas, angiomasyotras anomalíasvasculares, melanomas, melanocitomas, retinoblastomas, adenomasycarcinomasde tiroides y de paratiroides, tumores rabdoides malignosytumores teratoides-rabdoides, tumores germinales, hepatoblastomas, hepatocarcinomas, adenomasycarcinomas suprarrenales, paragangliomasyfeocromocitomas.

6. Kit para el pronóstico de tumores del desarrollo que comprende los pares de cebadores SEQ ID NO 1/SEQ ID NO2, SEQIDNO3/SEQIDNO4ySEQIDNO5/SEQIDNO6 útilesparallevaracabolaPCR específicade bisulfitoolosparesde cebadoresSEQIDNO9/SEQIDNO10ySEQIDNO11/SEQIDNO12útilesparallevara cabola PCR específicademetilaciónyopcionalmentela sonda marcadaBACRP11-79M2.

7.Kitde acuerdoconlareivindicación6que comprendelosparesde cebadoresSEQIDNO1/SEQIDNO2, SEQ IDNO3/SEQIDNO4ySEQIDNO5/SEQIDNO6útilesparallevaracabolaPCRespecíficade bisulfito.

8. Kit de acuerdo con la reivindicación6que comprende los pares de cebadores SEQ ID NO 9/SEQ ID NO 10y SEQIDNO 11/SEQIDNO12útiles para llevara cabola PCR específicade metilación.

9.Kitde acuerdo con cualquieradelasreivindicaciones7º8que comprendela sonda marcadaBACRP11-79M2.

10. Método para la confirmación del mal pronóstico de un tumor del desarrollo que comprende:

a) la determinación de hipermetilación en el promotor2 del gen CaR según un método de acuerdo con cualquierade las reivindicaciones1 a5, b) la determinación de la pérdida de una copia del gen CaR del cromosoma3 enel genoma del tumor.

11. Métodode acuerdo conlareivindicación10que comprendellevara cabo una hibridación fluorescente in situ (FISH) conla sonda marcadaBACRP11-79M2.

12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10y 11 donde el tumor del desarrollo se selecciona entre los tumores neuroblásticos como neuroblastomas, ganglioneuroblastomas oganglioneuromas, sarcomas de Ewing, rabdomiosarcomas alveolaresyembrionarios, osteosarcomas, sarcomas sinoviales, fibrosarcomas, miofibromatosisy otros tumores fibro-histiocitarios, tumores del sistema nervioso central comogliomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, gangliogliomas o xantoastrocitomas, tumores de Wilms y otros tumores renales, histiocitosis, schwanomas, neurofibromas, neurofibrosarcomas, leucemias, linfomas, teratomas, angiomasyotras anomalíasvasculares, melanomas, melanocitomas, retinoblastomas, adenomasycarcinomasde tiroides y de paratiroides, tumores rabdoides malignosytumores teratoides-rabdoides, tumores germinales, hepatoblastomas, hepatocarcinomas, adenomasycarcinomas suprarrenales, paragangliomasyfeocromocitomas.