Método para diagnosticar una infección por pseudomonas aeruginosa.
Un método para diagnosticar infección por Pseudomonas aeruginosa que comprende la etapa de exponer una muestra del paciente a una sonda de nucleótidos ,
en la que la sonda se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica PcrV y no con otros ácidos nucleicos.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06000111.
Solicitante: MCW Research Foundation, Incorporated.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 8701 Watertown Plank Road Milwaukee Wisconsin 53226 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: FRANK, DARA, W., YAHR, TIMOTHY, L., SAWA, TEIJI, WIENER-KRONISH, JEANINE.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K38/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
- A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
- A61K39/104 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Pseudomonas.
- A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- A61P11/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Medicamentos para el tratamiento de trastornos del aparato respiratorio.
- A61P31/00 A61P […] › Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos.
- A61P31/04 A61P […] › A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › Agentes antibacterianos.
- C07K14/21 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Pseudomonadaceae (F).
- C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/569 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
PDF original: ES-2379801_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Método para diagnosticar una infección por pseudomonas aeruginosa ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista capaz de causar infecciones pulmonares agudas fatales en individuos gravemente enfermos (1) . La capacidad de las bacterias para dañar el epitelio pulmonar ha sido vinculada a la expresión de toxinas que son inyectadas directamente en las células eucariotas a través de un mecanismo de secreción y translocación mediado de tipo III (2, 3) .
Las proteínas codificadas por el aparato de secreción-translocación de tipo III de la P.aeurginosa demuestran un alto nivel de identidad de aminoácidos con miembros del regulón Yop de la Yersinia (4-6) . De entre todos los sistemas de tipo III descubiertos en bacterias Gram-negativas, sólo P. aeruginosa posee un homólogo del antígeno Yersinia V, PcrV (véase 6 para revisar los sistemas tipo III) . Las proteínas homólogas del aparato secreción y translocación están codificadas por bacterias patógenas tanto animales como vegetales. Estos organismos incluyen patógenos humanos como Salmonella Typhimurium, Shigella flexneri, E. Coli enteropatógena, Chlamydia spp., y patógenos vegetales como Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora and Ralstonia solanacearum. No obstante, sólo P. aeruginosa y Yersinia codifican el antígeno V.
Yarh, et.al., 1997, describen la secuencia del operón que codifica PcrV y comparan la secuencia con la proteína LcrV. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de PcrV es conocida y está disponible con el número de acceso AF010149 de GenBank.
Anderson et al., (Infection and Inmunity, 1996, p4580-4585) describen que el antígeno recombinante V procedente de Yersinia pestis protege a ratones contra la peste bubónica y neumónica causadas por cepas de Yersinia pestis.
En el documento US 5.599.665 se describen los ácidos nucleicos de Pseudomonas aeruginosa que codifican la actividad de la Exoenzima S y su uso en la detección de infección por Pseudomonas aeruginosa.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Esta invención proporciona un método para el diagnóstico de infección por Pseudomonas aeruginosa que comprende la etapa de exponer una muestra del paciente a una sonda de nucleótidos, en la que la sonda se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica PcrV y no con otros ácidos nucleicos.
La invención también proporciona un método para diagnosticar infección por Pseudomonas aeruginosa que comprende las etapas de
(a) exponer una muestra del paciente a cebadores de nucleótidos diseñados para amplificar el gen pcrV,
(b) llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa en que el gen pcrV se amplifica si está presente en la muestra, y
(c) correlacionar infección por Pseudomonas aeruginosa con la presencia de un producto amplificado.
La invención proporciona adicionalmente un método para el diagnóstico de una infección por Pseudomonas aeruginosa que comprende las etapas de:
(a) exponer la muestra del paciente al antígeno PcrV, y
(b) correlacionar infección por Pseudomonas aeruginosa con la presencia de un complejo antígeno/anticuerpo específico de PcrV.
Por lo tanto, en una realización el ADN que codifica PcrV (denominado pcrV) o un fragmento de ADN se puede utilizar diagnósticamente para detectar infección por P. aeruginosa.
En otra realización, la proteína recombinante (rPcrV) se utiliza diagnósticamente para detectar anticuerpos de los pacientes. La respuesta de los anticuerpos del paciente a PcrV puede asociarse a un pronóstico. De esta forma, en esta realización la proteína recombinante se utiliza como indicador pronóstico mediante la medida del título de anticuerpos del paciente.
Es, por tanto, un objeto de esta invención detectar diagnósticamente infección por P. aeruginosa.
Otro objeto de la presente invención es detectar anticuerpos en pacientes con Pseudomonas.
Otros objetos, características y ventajas de esta invención resultarán evidentes para un experto en la técnica tras la revisión de la descripción, las reivindicaciones y los dibujos.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figs. 1A y 1B son un gel teñido (Fig. 1A) y una transferencia Western (Fig. 1B) que ilustran el análisis fenotípico de PA103LpcrV.
Las Figs. 2A y 2B son un gráfico (Fig. 2A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 2B) que ilustran la supervivencia y el daño pulmonar de cepas parentales y mutantes de P. aeruginosa.
Las Figs. 3A y 3B son un gráfico (Fig. 3A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 3B) que ilustran el efecto de la inmunización en la supervivencia, el daño pulmonar y la colonización bacteriana.
La Fig. 4 es un gráfico del número de animales que sobreviven a un prueba de ataque con 5 x 10 5 UFC/ ratón de la cepa PA103 tras la administración pasiva de IgG policlonal específica para PcrV, ExoU, PopD o IgC control procedente de un animal no inmunizado.
La Fig. 5 es un gráfico (Fig. 5A) y una serie de gráficos de barras (Fig. 5B) que ilustran la supervivencia y protección frente al daño pulmonar por la administración concomitante de IgG frente a diferentes antígenos y pruebas de ataque bacterianas. ANOVA unidireccional para daño pulmonar, p=0, 026, y edema pulmonar, p <0, 0005.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente memoria se describe que PcrV tiene un efecto regulador novedoso sobre la expresión de productos secretados de tipo III, está involucrada en la translocación de toxinas de tipo III, y es el primer antígeno que protege del daño pulmonar provocado por infección por P. aeruginosa. La vacunación contra PcrV previa a la instilación por vía aérea de IgG anti-PcrV no sólo aseguró la supervivencia de animales sometidos a la prueba de ataque sino que también redujo la inflamación pulmonar y el daño causado por la bacteria.
El LcrV, o el antígeno V, es una proteína multifuncional que regula la secreción/translocación de proteínas efectoras de Yop y tiene un papel extracelular en la patogénesis alterando la respuesta de las citoquinas del huésped a la infección por Yersinia (7-11) . El único homólogo conocido de este factor patogénico crítico es una proteína extracelular codificada por P aeruginosa, denominada PcrV.
Un método de moderar o inhibir la infección por Pseudomonas aeruginosa que comprende inmunizar un paciente con una cantidad efectiva del antígeno PcrV. Por "cantidad efectiva" se entiende una cantidad de antígeno PcrV eficaz para mostrar alguna moderación o inhibición de la infección por Pseudomonas por comparación con sujetos o animales control que no han sido tratados con el antígeno.
Por "moderar" se entiende que la infección se inhibe en al menos un cincuenta por ciento si se compara con un animal no inmunizado. Preferiblemente, la infección se previene completamente. Una estimación cuantitativa de la infección incluiría preferiblemente la determinación de la cantidad de bacterias en la corriente sanguínea o en los fluidos pleurales y/o la determinación de los parámetros de daño pulmonar. Por ejemplo, la ausencia de bacterias en la corriente sanguínea o en los fluidos pleurales indicará que se ha evitado la infección. Una reducción en parámetros de daño pulmonar indicará que la infección se ha moderado.
La infección podría estimarse cuantitativamente con otros indicadores clínicos, incluyendo la reducción de carga bacteriana en el esputo, la sangre o fluidos pleurales, la reducción de tamaño del infiltrado, la mejora en la oxigenación, la reducción del tiempo en ventilación mecánica, reducción de la fiebre y reducción en el recuento de glóbulos blancos.
Por "antígeno PcrV "se entiende la porción o fragmento de la proteína PcrV necesaria para incitar una respuesta inmune que previene o modera la infección. En este momento, se ha utilizado la proteína PcrV completa para inducir la protección. No obstante, un experto en la técnica puede trazar el mapa del epítopo protector en la molécula. Por ejemplo, la solicitante producirá anticuerpos monoclonales y los analizará para encontrar los anticuerpos que evitan la citotoxidad en cultivos tisulares. Los anticuerpos que impiden la citotoxicidad serán examinados en los modelos de infección pulmonar aguda para la protección pasiva contra la infección. Los anticuerpos monoclonales generalmente reconocen una... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un método para diagnosticar infección por Pseudomonas aeruginosa que comprende la etapa de exponer una muestra del paciente a una sonda de nucleótidos , en la que la sonda se hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica PcrV y no con otros ácidos nucleicos.
(a) exponer una muestra del paciente a cebadores de nucleótidos diseñados para amplificar el gen pcrV, (b) llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa, en la que el gen pcrV se amplifica si está presente en la muestra, y (c) correlacionar infección por Pseudomonas aeruginosa con la presencia de un producto amplificado (a) exponer un muestra del paciente al antígeno PcrV, y (b) correlacionar infección por Pseudomonas aeruginosa con la presencia de un complejo antígeno/anticuerpo específico de PcrV. 5 2. Un método para diagnosticar una infección por Pseudomonas aeruginosa que comprende las etapas de:
10 3. Un método para diagnosticar infección por Pseudomonas aeruginosa, que comprende las etapas de:
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