Un método para detectar células de carcinoma hepatocelular o células de carcinoma colangiocelular en una muestra que comprende medir dlk que se expresa en la superficie de células,

que utiliza una reacción antígeno-anticuerpo entre el dlk que se expresa en dichas superficies celulares y un anticuerpo anti-dlk o un fragmento del mismo de unión a antígeno.

Método de detección de cáncer de hígado, diagnóstico de cáncer de hígado y curación del cáncer Campo Técnico [0001] La presente invención se refiere a un método para detectar el cáncer de hígado, al diagnóstico del cáncer de hígado y a un fármaco terapéutico para el cáncer.

Técnica Antecedente [0002] El carcinoma hepatocelular es uno de los carcinomas más populares en el mundo y la aparición del mismo esespecialmente frecuente en el sudeste de Asia, China y el África Subsahariana. No menos de 30.000 personas mueren por cáncer de hígado en Japón al año, y el número de muertes está aumentando todavía. La mayoría del cáncer de hígado es carcinoma hepatocelular causado por la infección con el virus de la hepatitis. Sin embargo, todavía no está claro el mecanismo de transformación cancerosa de la hepatitis vírica en carcinoma hepatocelular por medio de cirrosis. Por lo tanto, los métodos de diagnóstico usados en la actualidad (ultrasonografía, diagnóstico por imagen mediante TC, hemodiagnóstico usando un marcador tumoral tal como α-fetoproteína) son los que se dirigen a tejidos cancerosos ya formados. Por lo tanto, aunque pueden detectar cánceres que han progresado en cierta medida, no pueden detectar células cancerosas en una etapa muy temprana o células precancerosas. Aunque el hemodiagnóstico usando AFP como marcador tumoral es sencillo, la especificidad para el cáncer de hígado no es elevada, y se sabe que el nivel de AFP también es elevado en la cirrosis y la hepatitis.

La tasa de mortalidad del cáncer en Japón ha aumentado desde aproximadamente 1980, y el cáncer es ahora la causa principal de muerte. Entre los cánceres, el número de muertes por cáncer de hígado es de 35.000 al año, que ocupa la tercera posición entre las muertes totales por cáncer. Se cree que el número de pacientes de cáncer de hígado aumentará adicionalmente a menos que se desarrolle un fármaco terapéutico y de diagnóstico que haga época. Las terapias actuales del cáncer de hígado incluyen tratamientos locales tales como la hepatectomía quirúrgica, terapia de infusión de etanol percutánea y embolización arterial hepática, y tratamientos sistémicos tales como administración sistémica de agentes anticancerosos e inmunoterapias. Las terapias principales son los tratamientos locales, y la hepatectomía es mejor que la terapia de infusión de etanol percutánea y la embolización arterial hepática en vista del índice de curación. Sin embargo, dependiendo del grado de disfunción del hígado y del área ocupada por el tumor, con frecuencia no puede practicarse la cirugía. Como para los tratamientos sistémicos, no se ha establecido una quimioterapia convencional. El cisplatino es el único fármaco que presentaba un índice de respuesta de no menos del 10% cuando se administraba en solitario, y no se ha establecido un tratamiento polifarmacológico (Bibliografía no de patente 1) . Como para la inmunoterapia, se ha descrito que el "Picibanilo (OK-432) " (CHUGAI PHARMACEUTICAL) , que es un inmunoestimulante, es eficaz para el cáncer de hígado. Incluso si se aplica dicha terapia, la cura completa del cáncer de hígado es difícil debido a su carcinogénesis multicéntrica y a su naturaleza recurrente. Se cree que es importante el desarrollo de un fármaco molecularmente dirigido (anticuerpo terapéutico) que ataque específicamente al cáncer de hígado.

En los últimos años, la comercialización y el desarrollo de fármacos molecularmente dirigidos que ataquen específicamente células cancerosas son cada vez más activos. Puesto que estos fármacos se dirigen a un gen diana que se expresa específicamente en un cáncer específico, tienen ventajas en el sentido de que son más eficaces que los agentes anticancerosos convencionales y tienen menos efectos secundarios. Por lo tanto, se cree que los fármacos molecularmente dirigidos se convertirán en la corriente principal del desarrollo de agentes anticancerosos. Los anticuerpos terapéuticos comercializados para cánceres incluyen "Herceptina (preparación de anticuerpo monoclonal humanizado anti-Her2) " (CHUGAI PHARMACEUTICAL) , que es un fármaco terapéutico para el cáncer de mama metastásico, en el cual se confirma un exceso de expresión de Her2, y "Rituxán (preparación de anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD20) (CHUGAI PHARMACEUTICAL y ZENYAKU KOGYO) , que es un fármaco terapéutico para linfoma no Hodgkin de tipo celular B positivo a CD20. Estos anticuerpos terapéuticos destruyen células cancerosas por un mecanismo inmune tal como citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Aunque el número de fármacos molecularmente dirigidos específicos de cáncer es pequeño, se espera que el índice de curación de cánceres incluyendo el cáncer de hígado aumente si se desarrollan productos farmacológicos que tengan alta especificidad para un cáncer.

Por otro lado, la Dlk1/Pref-1 es una proteína de membrana cuyo dominio extracelular tiene homología con la familia de Notch/Delta/Serrate. Se clonó la Dlk1/Pref-1 como una molécula que se expresaba en una línea celular derivada de carcinoma pulmonar microcítico sensible a GRP (péptido liberador de gastrina) (Bibliografía no de patente 1) o como un factor que inhibe la diferenciación de preadipocitos (Bibliografía no de patente 2) . Su expresión se observa en una pluralidad de tejidos y órganos durante el periodo fetal, pero no se observa en la mayoría de los tejidos después del nacimiento (Bibliografía no de patente 2 y 3) . Además, su expresión se observa en algunos tejidos cancerosos tales como el carcinoma pulmonar microcítico y la neurofibromatosis tipo 1 (Bibliografía no de patente 4 y 5) . En lo que se refiere a la función de Dlk1/Pref-1, además de la inhibición de la diferenciación de preadipocitos, recientemente se sugirió su participación en la hematopoyesis (Bibliografía no de patente 6) . Sin embargo, basándose en el patrón de expresión y similar, se ha sugerido la posibilidad de su participación en el mantenimiento de un estado indiferenciado en células no diferenciadas. Se había identificado anteriormente el gen de dlk, que estaba altamente expresado en el hígado de ratón a día embrionario 14, 5, por el método de inmovilización de señal que aísla selectivamente genes que codifican moléculas que tienen una secuencia señal, es decir, los que codifican antígenos de superficie celular y proteínas secretoras. La expresión de Dlk en el proceso de desarrollo del hígado de ratón se observa antes del día embrionario 10, y se expresa claramente hasta aproximadamente el día embrionario 16. Sin embargo, la expresión se disminuye espectacularmente alrededor del nacimiento y no se expresa en el hígado maduro (Bibliografía no de patente 7 y 13) . Además, se descubrió que las células madre hepáticas pueden purificarse hasta una alta pureza en una etapa a partir de hígado fetal usando un anticuerpo monoclonal anti-Dlk (Bibliografía no de patente 7, Bibliografía de Patente 1) .

Bibliografía no de patente 1: Laborda, J., et al (1993) J. Biol .Chem. 268 (6) : 3817-20.

Bibliografía no de patente 2: Smas, C. M., et al (1993) Cell. 73 (4) : 725-34.

Bibliografía no de patente 3: Floridon, C., et al (2000) Differentiation 66 (1) : 49-59.

Bibliografía no de patente 4: Harken, J. C., et al (1999) Tumour Biol. 20 (5) : 256-62.

Bibliografía no de patente 5: Jensen, C. H., et al (1999) Br. J. Dermatol. 140 (6) : 1054-9.

Bibliografía no de patente 6: Ohno, N., et al (2001) Stem Cells 19 (1) : 71-9.

Bibliografía no de patente 7: Tanimizu, N., et al (2003) J. Cell Sci. 116 (Pt 9) : 1775-86.

Bibliografía no de patente 8: Onishi, M., et al (1996) Exp. Hematol. 24; 324-329.

Bibliografía no de patente 9: Sell, S. (1993) Int. J. Dev. Biol. 37: 189-201.

Bibliografía no de patente 10: Jensen, C. H. et al (1994) Eur. J. Biochem. 225: 83-92.

Bibliografía no de patente 11: Kaneta, M. et al. (2000) J. Immunol. 164: 256-264.

Bibliografía no de patente 12: Okada, S., et al (1993) Oncology. 50 (1) : 22-26.

Bibliografía no de patente 13: Kitajima, T., et al (1999) Nat. Biotechnol. 17 (5) : 487-490.

Bibliografía no de patente 14: Jensen, C. H., et al (1999) Br. J. Dermatol. 140 (6) : 1054-1059.

Bibliografía no de patente 15: Russell, W. C., et al (1977) J. Gen. Virol. 36: 59-72.

Bibliografía no de patente 16: Kipps, T. J., et al (1985) J. Exp.... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar células de carcinoma hepatocelular o células de carcinoma colangiocelular en una muestra que comprende medir dlk que se expresa en la superficie de células, que utiliza una reacción antígeno-anticuerpo entre el dlk que se expresa en dichas superficies celulares y un anticuerpo anti-dlk o un fragmento del mismo de unión a antígeno.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo anti-dlk es un anticuerpo monoclonal.

3. Un método para detectar células de carcinoma hepatocelular o células de carcinoma colangiocelular, que comprende medir el dominio extracelular de dlk existente en sangre recogida del cuerpo, que utiliza una reacción antígeno-anticuerpo entre el dominio extracelular del dlk existente en dicha sangre y un anticuerpo anti-dlk o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo anti-dlk es un anticuerpo monoclonal.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha sangre es sangre humana y dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal anti-dlk humano.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método es para detectar el carcinoma en un estadio temprano.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el método es para detectar un carcinoma hepatocelular en un estadio temprano.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el carcinoma hepatocelular es de Grado I o Grado II.

9. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno, que sufre una reacción antígeno-anticuerpo con un dominio extracelular de dlk para la producción de un diagnóstico para el cáncer de hígado.

10. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión a antígeno, que sufre una reacción antígeno-anticuerpo con un dominio extracelular de dlk, in vitro como diagnóstico del cáncer de hígado.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-dlk humano.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el método es para detectar un carcinoma en un estadio temprano.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que el método es para detectar un carcinoma hepatocelular en un estadio temprano.

14. El uso de la reivindicación 13, en el que el carcinoma hepatocelular es de Grado I o Grado II.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción