Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos.

Un método para secuenciar ácidos nucleicos que comprende:

(a) fragmentar moléculas de ácido nucleico plantilla grandes para generar una pluralidad de ácidos nucleicosfragmentados;

(b) suministrar una población de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla a un sistema (array) de almenos 10.000 cámaras de reacción sobre una superficie plana, en donde una pluralidad de los pocillos nocomprende más de una partícula y un único ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla;

(c) amplificar los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla en las cámaras de reacción, en donde unapluralidad de copias amplificadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla son inmovilizadossobre partículas; y

(d) llevar a cabo una reacción de secuenciamiento simultáneamente en una pluralidad de las cámaras dereacción que comprenden las copias amplificadas inmovilizadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadenasencilla.

Métodos de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a un método para secuenciar ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El desarrollo de métodos de secuenciamiento de ácido nucleicos rápidos y sensibles que utilizan secuenciadores de ADN automatizados ha revolucionado la biología molecular moderna. El análisis de genomas completos de plantas, hongos, animales, bacterias y virus es ahora posible mediante el esfuerzo combinado de una serie de máquinas y de un equipo de técnicos. Sin embargo, no se ha podido alcanzar el objetivo de un secuenciamiento rápido y automatizado, o semiautomático, de un genoma en un periodo de tiempo corto. Sigue habiendo problemas técnicos para una preparación, amplificación y secuenciamiento de muestra precisos.

Un problema técnico que ha dificultado el análisis de secuencia de genomas es la incapacidad para amplificar representativamente un genoma a un nivel que sea compatible con la sensibilidad de los métodos de secuenciamiento actuales. Las máquinas de secuenciamiento modernas económicamente viables, aunque sensibles, requieren todavía un exceso de un millón de copias de un fragmento de ADN para el secuenciamiento. Los métodos actuales para proporcionar un elevado número de copias de secuenciamiento de ADN implican variaciones de clonación o amplificación in vitro, que no pueden amplificar el número de clones individuales (600.000

o más, y decenas de millones para un genoma humano) necesarios para secuenciar un genoma completo de forma económica.

Otro problema técnico es la limitación de los métodos de secuenciamiento actuales que como mucho pueden llevar a cabo una reacción de secuenciación por hibridación de cebador de oligonucleótido. La hibridación de cebadores de secuenciamiento a menudo es la etapa limitante que reduce la productividad de los secuenciadores de ADN.

En la mayoría de los casos, la Cadena en Reacción de Polimerasa (PCR de las siglas en inglés; Saiki, R.K. y col., Science 1985, 230, 1350-1354; Mullis, K., y col., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986, 51 Pt 1, 263-273) constituye una parte integral de la obtención de información de secuencias de ADN, amplificando cantidades minúsculas de ADN específico para obtener concentraciones suficientes para el secuenciamiento. Aún así, el escalado de la tecnología de PCR actual para cubrir la demanda creciente de la técnica genética moderna no es económico ni eficiente, especialmente cuando se consideran los requerimientos de un secuenciamiento de genoma completo.

Los esfuerzos para maximizar la eficacia económica y de tiempo se han dirigido habitualmente a dos áreas: la disminución del volumen de reacción requerido para las amplificaciones y el aumento del número de amplificaciones simultáneas llevadas a cabo. La miniaturización confiere la ventaja de una menor utilización de muestra y reactivos, menores tiempos de amplificación y aumento de la escalabilidad de la producción.

Aunque los termocicladores convencionales requieren tiempos de ciclo relativamente largos debido másicas y térmicas (Woolley, A.T. y col., Anal. Chem. 1996, 68, 4081-4086) , se pueden ciclar más rápidamente volúmenes de reacción más pequeños. Los dispositivos de PCR de flujo continuo han utilizado microcanales en combinación con zonas de temperatura fija para reducir los volúmenes de reacción hasta niveles de muestra por debajo de microlitros (Lagally, E.T. y col., Analytical Chemistr y 2001, 73, 565-570; Schneegas, I. y col., Lab on a Chip – The Royal Society of Chemistr y 2001, 1, 42-49) .

Los microcapilares de vidrio, calentados por aire (Kalimina, O. y col., Nucleic Acid Res. 1997, 25, 1999-2004) o luz infrarroja (Oda, R.P. y col., Anal. Chem. 1998, 70, 4361-4368; Huhmer, A.F. y Landers, J.P., Anal. Chem. 2000, 72, 5507-5512) , también han servido como recipientes eficientes para reacciones a escala de nanolitros. Se han conseguido volúmenes de reacción similares con termocicladores de silicona microfabricados (Burns, M.A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 5556, 5561) .

En muchos casos, estas miniaturizaciones han reducido los tiempos de reacción de PCR hasta menos de 30 minutos para elementos de calefacción eléctrica modificados (Kopp, M.U. y col., Science 1998, 280, 1046-1048; Chiou, J., Matsudaira, P., Sonin, A. y Ehrlich, D., Anal. Chem. 2001, 73, 2018-2021) y cicladores de aire caliente (Kalinina, O., y col., Nucleic Acids Res. 1997, 25, 1999-2004) , y hasta 240 segundos para algunas reacciones controladas por infrarrojos (Giordano, B.C., y col., Anal. Biochem. 2001, 291, 124-132) .

Determinadas tecnologías emplean una producción incrementada y miniaturización simultáneamente; como en el diseño de sistema de 1536 pocillos de Sasaki y col. (Sasaki, N. y col., DNA Res. 1997, 4, 387-391) , que mantenía volúmenes de reacción inferiores a 1 μL. Como ejemplo adicional, Nagai y col. (Nagai, H. y col., Biosens. Bioelectron. 2001, 16, 1015-1019; Nagai, H. y col., Anal. Chem. 2001, 73, 1043-1047) presentaron la amplificación de un fragmento de ensayo individual en diez mil pocillos de reacción de 86 pL grabados en una única oblea de silicio. Desafortunadamente, la recuperación y la utilización de la ampliación de estos métodos han demostrado ser A pesar de estas mejoras destacables en los volúmenes de reacción y los tiempos de ciclo, ninguna de las estrategias previas han proporcionado la amplificación masivamente paralela requerida para aumentar de forma drástica la productividad hasta los niveles requeridos para el análisis del genoma humano completo. Los secuenciadores de ADN siguen siendo más lentos y más caros de lo que sería deseable. En los dispositivos de investigación pura quizás es aceptable que un secuenciador sea lento y caro. Pero cuando se desea usar secuenciadores de ADN en un sistema de diagnóstico clínico dichos métodos de secuenciamiento ineficientes son prohibitivos incluso para una institución bien financiada. El secuenciamiento en paralelo a gran escala de miles de dianas amplificadas clonalmente facilitaría enormemente el análisis a gran escala de bibliotecas de genomas completos sin el tedioso proceso de preparación de muestras y los caros procesos de clonación de elevado error. Una amplificación de ADN exitosa de alta capacidad, en fase sólida, clonal, puede usarse para numerosas aplicaciones. Por consiguiente, está claro que existe una necesidad de preparar un genoma o ácidos nucleicos grandes de plantilla para el secuenciamiento, de amplificación de la plantilla de ácido nucleico, y de secuenciamiento de los ácidos nucleicos plantilla amplificados sin la limitación de una reacción de secuenciamiento por hibridación. Además, existe una necesidad de un sistema para conectar estas diversas tecnologías en una máquina de secuenciamiento automática o semiautomática.

La patente EP 0 392 546 describe un proceso para la detección de secuencias de ácido nucleico parcial o entero mediante la hibridación de las muestras en una mezcla que se caracteriza porque moléculas de ADN o ARN multiplicadas o sintetizadas o separadas en reacciones separadas están ligadas a partículas discretas de tamaño microscópico que pueden discriminarse según sus características físicas y químicas.

La patente WO 01/20039 describe un método para pirosecuenciar un ácido nucleico, que comprende proporcionar un complejo cebador ancla imprimado-plantilla circular, que combina el complejo con una polimerasa para generar copias complementarias de plantilla circular y secuenciar el ácido nucleico.

La patente WO 02/077287 describe un método de pirosecuenciamiento, en donde el cebador ancla está unido a un soporte sólido, tanto antes, como después, como durante la formación del cebador de ancla extendido.

La patente WO 98/44152 describe un método en el que se pueden secuenciar en paralelo diferentes moléculas de ácido nucleico presentes en diferentes localizaciones.

La patente WO 02/20837 describe un método para tipificar uno o más ácidos nucleicos que comprende: llevar a cabo simultánea o secuencialmente dos o más reacciones de extensión de cebador, uniéndose cada cebador en una posición pre-determinada diferente dentro de dicha molécula de ácido nucleico, y determinar el modelo de incorporación de ácido nucleico.

RESUMEN BREVE DE LA INVENCIÓN

Esta descripción describe un sistema integrado que comprende métodos nuevos y aparatos nuevos para (1) la preparación de muestras de ácido nucleico, (2) la amplificación de ácido nucleico, y (3) el secuenciamiento de ADN.

De acuerdo con la invención se proporciona un método para secuencia ácido nucleico... [Seguir leyendo]

1. Un método para secuenciar ácidos nucleicos que comprende:

(a) fragmentar moléculas de ácido nucleico plantilla grandes para generar una pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados;

(b) suministrar una población de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla a un sistema (array) de al menos 10.000 cámaras de reacción sobre una superficie plana, en donde una pluralidad de los pocillos no comprende más de una partícula y un único ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla;

(c) amplificar los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla en las cámaras de reacción, en donde una pluralidad de copias amplificadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla son inmovilizados sobre partículas; y

(d) llevar a cabo una reacción de secuenciamiento simultáneamente en una pluralidad de las cámaras de reacción que comprenden las copias amplificadas inmovilizadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla.

2. El método de la reivindicación 1 en el que:

(i) las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm;

(ii) los ácidos nucleicos fragmentados tienen entre 30 y 500 bases;

(iii) la etapa de amplificación se lleva a cabo usando reacción en cadena de polimerasa; o (iv) la reacción de secuenciamiento es una reacción de secuenciamiento basada en pirofosfato.

3. El método de la reivindicación 1 en el que la reacción de secuenciamiento comprende las etapas de:

(i) madurar una cantidad efectiva de un cebador de secuenciamiento con las plantillas de ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla y extender el cebador de secuencia con una polimerasa y un trifosfato de nucleótido predeterminado para dar lugar a un producto de secuenciamiento y, si el trifosfato de nucleótido predeterminado se incorpora en el extremo 3’ de dicho cebador de secuenciamiento, un subproducto de la reacción de secuenciamiento; y

(ii) identificar el subproducto de la reacción de secuenciamiento, determinando con ello la secuencia del ácido nucleico en una pluralidad de las cámaras de reacción.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción de secuenciamiento comprende las etapas de:

(a) hibridar dos o más cebadores de secuenciamiento a una o una pluralidad de cadenas sencillas de la molécula de ácido nucleico, en donde todos los cebadores excepto uno son cebadores bloqueados reversiblemente;

(b) incorporar al menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante alargamiento de polimerasa a partir de un cebador desbloqueado;

(c) prevenir un alargamiento adicional de dicho cebador desbloqueado;

(d) desbloquear uno de los cebadores bloqueados reversiblemente en un cebador desbloqueado; y

(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que al menos uno de los cebadores bloqueados reversiblemente sea desbloqueado y usado para determinar una secuencia.

5. El método de la reivindicación 1, en el que las cámaras de reacción son cavidades formadas mediante grabado de un extremo de un haz de fibra óptica.