Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión en perlas.

Un metodo para enriquecer un amplicón, que comprende:

(a) distribuir una solución que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde,

en una pluralidad de gotitas de emulsión acuosa en una fase oleosa termoestable;

en el que un primer subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas y una o mas de las especies de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

(b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde del primer subconjunto de gotitas, en el que una o mas perlas del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplicón inmovilizado en ellas;

(c) romper las gotitas de emulsión acuosa para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

(d) hibridar con el amplicón inmovilizado en las perlas un cebador que es complementario del extremo 3' del amplicón;

y o bien:

(e) (i) formar un complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana, y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condición selectiva; y

(f) (i) aplicar la condición selectiva para aislar el complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, desde las perlas que no tienen amplicón unido; o bien

(e) (ii) exponer las perlas con amplicón inmovilizado a una o mas superficies de unión que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplicón inmovilizado, y separar las perlas con amplicón inmovilizado desde las perlas que no tienen amplicón unido.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09175588.

Solicitante: 454 LIFE SCIENCES CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1 Commercial Street Branford CT 06405 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LEAMON,JOHN,H, LOHMAN,KENTON, BERKA,JAN, CHEN,YI-JU, LEFKOWITZ,STEVEN, MAKHIJANI,VINOD, SARKIS,GARY,J, ROTHBERG,JONATHAN, WEINER,MICHAEL, SRINIVASAN,MAITHREYAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • B01L3/00 SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B01 PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL.B01L APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA, DE USO GENERAL (aparatos de uso médico o farmacéutico A61; aparatos para aplicaciones industriales o aparatos de laboratorio cuya estructura y funciones son comparables a las de aparatos industriales similares, ver las clases relativas a los aparatos industriales, en particular las subclases B01 y C12; aparatos de separación o de destilación B01D; dispositivos de mezcla o de agitación B01F; atomizadores B05B; tamices, cribas B07B; tapones, capuchones B65D; manipulación de líquidos en general B67; bombas de vacío F04; sifones F04F 10/00; grifos, válvulas F16K; tubos, empalmes para tubos F16L; aparatos especialmente adaptados al estudio y análisis de materiales G01, particularmente G01N; aparatos eléctricos u ópticos, ver las subclases apropiadas en las secciones G y H). › Recipientes o utensilios para laboratorios, p. ej. cristalería de laboratorio (botellas B65D; equipos para enzimología o microbiología C12M 1/00 ); Cuentagotas (recipientes para volumetría G01F).
  • C07H21/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos.
  • C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12P19/34 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N21/25 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 21/00 Investigación o análisis de los materiales por la utilización de medios ópticos, es decir, utilizando rayos infrarrojos, visibles o ultravioletas (G01N 3/00 - G01N 19/00 tienen prioridad). › Color; Propiedades espectrales, es decir, comparación del efecto del material sobre la luz para varias longitudes de ondas o varias bandas de longitudes de ondas diferentes.
  • G01N21/64 G01N 21/00 […] › Fluorescencia; Fosforescencia.

PDF original: ES-2380893_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Amplificación de acidos nucleicos en emulsión en perlas

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a metodos para amplificar moldes de acidos nucleicos desde bajo numero de copias hasta cantidades que permiten la secuenciación sobre un soporte sólido tal como una perla. La presente invención se dirige a separación cero de las perlas. Tambien se describe un metodo de enriquecimiento de soportes sólidos que contienen acidos nucleicos amplificados.

Antecedentes de la invención

La capacidad de amplificar una pluralidad de secuencias de acidos nucleicos tales como un banco genómico o un banco de DNA, es critica, dada la ineficacia de los metodos actuales de secuenciación.. Las tecnologias de secuenciación actuales requieren millones de copias de acido nucleico por cada reacción de secuenciación. Ademas, la secuenciación de un genoma humano podria requerir, aproximadamente, decenas de millones de reacciones de secuenciación diferentes. Si el material de partida es limitado, es necesaria la amplificación del DNA inicial antes de realizar la secuenciación genómica. El material de partida puede estar limitado, por ejemplo, si el genoma que ha de ser secuenciado procede de indicios de un patógeno o de un paciente prenatal. Las tecnicas actuales de amplificación genómica in vitro implican protocolos de clonación y de cultivo que han limitado la utilidad de la secuenciación genómica. Otras tecnicas, tales como peR, si bien rapidas y dignas de confianza, son incapaces de amplificar un genoma de un modo representativo.

Aun cuando puede construirse con facilidad por ingenieria genetica una peR aleatoria con cebador para amplificar una pluralidad de acidos nucleicos en una reacción, este metodo no es preferido debido a que el banco de DNA amplificado no es representativo del banco de partida. Es decir, en el ambiente de una peR aleatoria algunas secuencias de DNA son amplificadas preferentemente a expensas de otras secuencias, de modo que el producto amplificado no representa el material de partida.. Este problema de la peR puede ser obviado si cada miembro individual de un banco de DNA es amplificado en una reacción separada. No obstante, este enfoque puede no ser practico si se requieren muchos miles de tubos de reacción separados para el procedimiento de amplificación, dado que un banco genómico o un banco de DNA puede incluir mas de 100.000 fragmentos. La amplificación individual de cada fragmento de estos bancos en reacciones separadas, no es practica.

Griffiths et al., EMBO Journal, 22:1, Enero 2003, paginas 24-35, se refieren a la evolución dirigida de una fosfotriesterasa, sumamente rapida, mediante compartimentación in vitro.

El documento WO00/50712 describe un metodo óptico de clasificación utilizado para aislar uno o mas elementos geneticos que codifican un producto genico que posee una actividad deseada.

El documento WO 02/10301 describe un metodo selectivo de amplificación genica en el que se amplifica selectivamente un acido nucleico que codifica un producto genico seleccionado que posee una actividad deseada.

Fr y et al., Biotechniques, 13: 1, Enero, 1992, paginas 124-131, describen un metodo de hibridación y purificación que emplea particulas paramagneticas, que se utiliza para la purificación de DNA, especificamente para aplicaciones de secuenciación.

Sumario de la invención

Segun la presente invención, se proporciona un metodo para enriquecer un amplicón, que comprende:

(a) distribuir una solución que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde, en una pluralidad de gotitas acuosas de emulsión en una fase oleosa termoestable, en el que un primer subconjunto de las gotitas comprende una o mas de las perlas y una o mas de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprende una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

45 (b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde existentes dentro del primer subconjunto de gotitas, en el que una o mas perlas dentro del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplicón inmovilizado en ellas;

(c) romper las gotitas acuosas de emulsión para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

(d) someter a hibridación de acidos nucleicos al amplicón inmovilizado en las perlas con un cebador que es 50 complementario del extremo 3' del amplicón; y o bien: (e) (i) formar un complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condición selectiva; y (f) (i) aplicar la condición selectiva para aislar el complejo de perla con amplicón inmovilizado y. perla de 5 enriquecimiento, de aquellas perlas que no tienen amplicón unido;

o bien (e) (ii) exponer las perlas con amplicón inmovilizado a una o mas superficies de unión que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplicón inmovilizado, y separar las perlas con amplicón inmovilizado de las perlas que no tienen amplicón unido.

Se describe en esta memoria un metodo para amplificar una pluralidad de acidos nucleicos (por ejemplo, cada una de las secuencias de un banco de DNA, transcriptoma o genoma) de un modo rapido y económico en un unico tubo de reacción. Un uso del metodo es para llevar a cabo la amplificación clonal simultanea (por ejemplo, por peR) de una pluralidad de muestras (tantas como varios cientos de miles) en un recipiente de reacción. Esta descripción proporciona, ademas, medios para encapsular individualmente una pluralidad de muestras de DNA en una microcapsula de una emulsión (es decir, un microrreactor) , llevando a cabo simultaneamente la amplificación de la pluralidad de muestras de acido nucleico encapsuladas, y el desprendimiento desde las microcapsulas de dicha pluralidad de DNA amplificada, para efectuar las reacciones subsiguientes.

eopias unicas de las especies de moldes de acidos nucleicos pueden ser hibridadas con perlas de captura que comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos de captura o grupos quimicos que se unen al molde de acido nucleico. Las perlas son suspendidas en una solución de amplificación completa (vease el Ejemplo 2 como ejemplo de una solución de amplificación) y emulsionadas para producir microrreactores (tipicamente de 100 a 200 micr6metros de diametro) . Despues de esto, se usa amplificación (por ejemplo, por peR) para aumentar clonalmente en los microrreactores el numero de copias de la especie inicial de molde, y estas copias se unen a las perlas de captura de los microrreactores.

Alternativamente, pueden anadirse perlas de captura a una mezcla de reacción de amplificación (por ejemplo, una solución de amplificación del Ejemplo 2) que comprende un molde de acido nucleico, y esta mezcla se emulsiona para producir microrreactores. La amplificación (por ejemplo, por peR) se utiliza para aumentar clonalmente en los microrreactores el numero de copias de la especie de molde inicial, y estas copias se unen a las perlas de captura de los microrreactores.

Ventajosamente, los microrreactores permiten la amplificación simultanea clonal y discreta de muchos moldes diferentes sin contaminación cruzada de los productos amplificados o de los reactivos., o el dominio de un molde particular o de una serie de moldes (por ejemplo, predisposición de peR) . La reacción de amplificación, por ejemplo, puede ser llevada a cabo simultaneamente con al menos 3.000 microrreactores por microlitro de mezcla de reacción.

preferiblemente, cada microrreactor comprende una o pocas especies de molde amplificado.

Los microrreactores pueden tener un tamano medio de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 250 μm. preferiblemente, los microrreactores tienen un diametro medio de aproximadamente 60 a aproximadamente 200 μm. Mas preferiblemente. los microrreactores tienen un diametro medio de aproximadamente 60 μm tal como una media de 40 μm a 80 μm de diametro. Los microrreactores pueden tener un diametro medio de 60 μm aproximadamente.

preferiblemente, los microrreactores tienen un volumen medio de aproximadamente 113 pl. Lo mas preferible, aproximadamente 3.000 microrreactores estan contenidos en un microlitro... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un metodo para enriquecer un amplicón, que comprende:

(a) distribuir una solución que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde, en una pluralidad de gotitas de emulsión acuosa en una fase oleosa termoestable;

en el que un primer subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas y una o mas de las especies de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

(b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde del primer subconjunto de gotitas, en el 10 que una o mas perlas del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplicón inmovilizado en ellas;

(c) romper las gotitas de emulsión acuosa para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

(d) hibridar con el amplicón inmovilizado en las perlas un cebador que es complementario del extremo 3' del amplicón; y o bien:

(e) (i) formar un complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana, y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condición selectiva; y (f) (i) aplicar la condición selectiva para aislar el complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, desde las perlas que no tienen amplicón unido; o bien (e) (ii) exponer las perlas con amplicón inmovilizado a una o mas superficies de unión que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplicón inmovilizado, y separar las perlas con amplicón inmovilizado desde las perlas que no tienen amplicón unido.

2. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la solución comprende una razón del numero de las moleculas de acido nucleico de molde al numero de las perlas, menor que 1

25 3. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la solución comprende, ademas, una mezcla suficiente de reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación de las especies de moleculas de acido nucleico de molde.

4. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la etapa de amplificación emplea un procedimiento de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa.

30 5. El metodo segun la reivindicación 1, en el que el cebador complementario del extremo 3' del amplicón de la etapa

(d) tiene, al menos, 15 bases.

6. El metodo segun la reivindicación 1, en el que el metodo comprende las etapas (e) (i) y (f) (i) y en el que la condición selectiva comprende un campo magnetico que permite aislar una o mas de las perlas de enriquecimiento desde las perlas del segundo subconjunto.

35 7. El metodo segun la reivindicación 1, que comprende, ademas, determinar una composición de acido nucleico para la una o mas especies de moleculas de acido nucleico de molde.

8, El metodo segun la reivindicación 1, que comprende, ademas, reciclar y reutilizar las perlas del segundo subconjunto.

9. El metodo segun la reivindicación 1, en el que el cebador complementario del extremo 3' del amplicón de la etapa (d) , es un cebador biotinilado que en la etapa (e) (i) o en la etapa (e) (ii) esta inmovilizado por un resto de estreptavidina formando un par de biotina-estreptavidina, de captura-diana.

10. El metodo segun la reivindicación 1, que comprende, ademas, extender el cebador hibridado con el extremo 3' del amplicón de la etapa (d) por adición de DNA polimerasa y de los cuatro desoxinucleótido trifosfatos (dNTps) naturales a la mezcla de perlas, en el que la extensión intensifica la unión entre el cebador y el amplicón 45 inmovilizado en la perla.

11. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la reivindicación 1 comprende la etapa (c) (ii) y en el que el metodo comprende, ademas: verter las perlas del primer y segundo subconjuntos que existen en una solución, sobre la una o mas superficies de unión, en el que las perlas del segundo subconjunto permanecen en la solución 12. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la reivindicación 1 comprende las etapas (e) (i) y (f) (i) y en el que el metodo comprende, ademas: separar el cebador desde el amplicón inmovilizado en la perla para separar las perlas de enriquecimiento desde las perlas con amplicón inmovilizado.

30

31

32

33

34

35

36

37

38


 

Patentes similares o relacionadas:

Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN, del 6 de Marzo de 2019, de WHITEHEAD INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH: Un procedimiento para producir ARN bicatenario desde 21 hasta 23 nucleótidos de longitud que comprende: (a) combinar ARN bicatenario con […]

Funcionalización de superficie sin catalizador e injerto de polímero, del 18 de Febrero de 2019, de ILLUMINA, INC: Un sustrato que comprende una primera superficie que comprende silano o un derivado de silano unido covalentemente a una molécula funcionalizada a través de la reacción […]

Métodos para tratar la esclerosis múltiple usando oligonucleótidos antisentido, del 13 de Febrero de 2019, de ANTISENSE THERAPEUTICS LTD (100.0%): Composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido que tiene la estructura: […]

Composiciones que comprenden dinucleótidos cíclicos de purina que tienen estereoquímicas definidas y métodos para su preparación y uso, del 6 de Febrero de 2019, de Aduro BioTech, Inc: Una composicion para usar en un metodo de induccion de una respuesta inmunitaria contra un cancer en un individuo, o induccion de una respuesta inmunitaria contra un patogeno […]

Nucleótidos etiquetados, del 26 de Diciembre de 2018, de ILLUMINA CAMBRIDGE LIMITED: Un nucleósido o nucleótido que tiene una base unida a una etiqueta detectable a través de un conector disociable, caracterizado porque el conector […]

Anticuerpo monomérico Fc, del 7 de Noviembre de 2018, de AMGEN INC.: Un polipéptido Fc monomérico que comprende un dominio CH2 y CH3, en el que dicho dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG y comprende: (a) dos o más aminoácidos cargados […]

1L1RL-1 como un marcador de enfermedades cardiovasculares, del 10 de Octubre de 2018, de THE BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL, INC.: Un agente que es un agente antiinflamatorio, un agente antitrombótico, un agente antiplaquetario, un agente fibrinolítico, un agente reductor de lípidos, un inhibidor […]

Traductores secuestrados rotatoriamente, del 20 de Septiembre de 2018, de Emerald Therapeutics, Inc: Una composición que comprende un primer y un segundo compuesto de ácido nucleico cada uno comprendiendo una primera, una segunda, una tercera, y una cuarta cadena de […]

Otras patentes de 454 LIFE SCIENCES CORPORATION

 

Otras patentes de la CIP G01N21/64