Un metodo para enriquecer un amplicón, que comprende:

(a) distribuir una solución que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde,

en una pluralidad de gotitas de emulsión acuosa en una fase oleosa termoestable;

en el que un primer subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas y una o mas de las especies de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

(b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde del primer subconjunto de gotitas, en el que una o mas perlas del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplicón inmovilizado en ellas;

(c) romper las gotitas de emulsión acuosa para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

(d) hibridar con el amplicón inmovilizado en las perlas un cebador que es complementario del extremo 3' del amplicón;

y o bien:

(e) (i) formar un complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana, y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condición selectiva; y

(f) (i) aplicar la condición selectiva para aislar el complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, desde las perlas que no tienen amplicón unido; o bien

(e) (ii) exponer las perlas con amplicón inmovilizado a una o mas superficies de unión que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplicón inmovilizado, y separar las perlas con amplicón inmovilizado desde las perlas que no tienen amplicón unido.

Amplificación de acidos nucleicos en emulsión en perlas

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a metodos para amplificar moldes de acidos nucleicos desde bajo numero de copias hasta cantidades que permiten la secuenciación sobre un soporte sólido tal como una perla. La presente invención se dirige a separación cero de las perlas. Tambien se describe un metodo de enriquecimiento de soportes sólidos que contienen acidos nucleicos amplificados.

Antecedentes de la invención

La capacidad de amplificar una pluralidad de secuencias de acidos nucleicos tales como un banco genómico o un banco de DNA, es critica, dada la ineficacia de los metodos actuales de secuenciación.. Las tecnologias de secuenciación actuales requieren millones de copias de acido nucleico por cada reacción de secuenciación. Ademas, la secuenciación de un genoma humano podria requerir, aproximadamente, decenas de millones de reacciones de secuenciación diferentes. Si el material de partida es limitado, es necesaria la amplificación del DNA inicial antes de realizar la secuenciación genómica. El material de partida puede estar limitado, por ejemplo, si el genoma que ha de ser secuenciado procede de indicios de un patógeno o de un paciente prenatal. Las tecnicas actuales de amplificación genómica in vitro implican protocolos de clonación y de cultivo que han limitado la utilidad de la secuenciación genómica. Otras tecnicas, tales como peR, si bien rapidas y dignas de confianza, son incapaces de amplificar un genoma de un modo representativo.

Aun cuando puede construirse con facilidad por ingenieria genetica una peR aleatoria con cebador para amplificar una pluralidad de acidos nucleicos en una reacción, este metodo no es preferido debido a que el banco de DNA amplificado no es representativo del banco de partida. Es decir, en el ambiente de una peR aleatoria algunas secuencias de DNA son amplificadas preferentemente a expensas de otras secuencias, de modo que el producto amplificado no representa el material de partida.. Este problema de la peR puede ser obviado si cada miembro individual de un banco de DNA es amplificado en una reacción separada. No obstante, este enfoque puede no ser practico si se requieren muchos miles de tubos de reacción separados para el procedimiento de amplificación, dado que un banco genómico o un banco de DNA puede incluir mas de 100.000 fragmentos. La amplificación individual de cada fragmento de estos bancos en reacciones separadas, no es practica.

Griffiths et al., EMBO Journal, 22:1, Enero 2003, paginas 24-35, se refieren a la evolución dirigida de una fosfotriesterasa, sumamente rapida, mediante compartimentación in vitro.

El documento WO00/50712 describe un metodo óptico de clasificación utilizado para aislar uno o mas elementos geneticos que codifican un producto genico que posee una actividad deseada.

El documento WO 02/10301 describe un metodo selectivo de amplificación genica en el que se amplifica selectivamente un acido nucleico que codifica un producto genico seleccionado que posee una actividad deseada.

Fr y et al., Biotechniques, 13: 1, Enero, 1992, paginas 124-131, describen un metodo de hibridación y purificación que emplea particulas paramagneticas, que se utiliza para la purificación de DNA, especificamente para aplicaciones de secuenciación.

Sumario de la invención

Segun la presente invención, se proporciona un metodo para enriquecer un amplicón, que comprende:

(a) distribuir una solución que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde, en una pluralidad de gotitas acuosas de emulsión en una fase oleosa termoestable, en el que un primer subconjunto de las gotitas comprende una o mas de las perlas y una o mas de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprende una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

45 (b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde existentes dentro del primer subconjunto de gotitas, en el que una o mas perlas dentro del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplicón inmovilizado en ellas;

(c) romper las gotitas acuosas de emulsión para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

(d) someter a hibridación de acidos nucleicos al amplicón inmovilizado en las perlas con un cebador que es 50 complementario del extremo 3' del amplicón; y o bien: (e) (i) formar un complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condición selectiva; y (f) (i) aplicar la condición selectiva para aislar el complejo de perla con amplicón inmovilizado y. perla de 5 enriquecimiento, de aquellas perlas que no tienen amplicón unido;

o bien (e) (ii) exponer las perlas con amplicón inmovilizado a una o mas superficies de unión que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplicón inmovilizado, y separar las perlas con amplicón inmovilizado de las perlas que no tienen amplicón unido.

Se describe en esta memoria un metodo para amplificar una pluralidad de acidos nucleicos (por ejemplo, cada una de las secuencias de un banco de DNA, transcriptoma o genoma) de un modo rapido y económico en un unico tubo de reacción. Un uso del metodo es para llevar a cabo la amplificación clonal simultanea (por ejemplo, por peR) de una pluralidad de muestras (tantas como varios cientos de miles) en un recipiente de reacción. Esta descripción proporciona, ademas, medios para encapsular individualmente una pluralidad de muestras de DNA en una microcapsula de una emulsión (es decir, un microrreactor) , llevando a cabo simultaneamente la amplificación de la pluralidad de muestras de acido nucleico encapsuladas, y el desprendimiento desde las microcapsulas de dicha pluralidad de DNA amplificada, para efectuar las reacciones subsiguientes.

eopias unicas de las especies de moldes de acidos nucleicos pueden ser hibridadas con perlas de captura que comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos de captura o grupos quimicos que se unen al molde de acido nucleico. Las perlas son suspendidas en una solución de amplificación completa (vease el Ejemplo 2 como ejemplo de una solución de amplificación) y emulsionadas para producir microrreactores (tipicamente de 100 a 200 micr6metros de diametro) . Despues de esto, se usa amplificación (por ejemplo, por peR) para aumentar clonalmente en los microrreactores el numero de copias de la especie inicial de molde, y estas copias se unen a las perlas de captura de los microrreactores.

Alternativamente, pueden anadirse perlas de captura a una mezcla de reacción de amplificación (por ejemplo, una solución de amplificación del Ejemplo 2) que comprende un molde de acido nucleico, y esta mezcla se emulsiona para producir microrreactores. La amplificación (por ejemplo, por peR) se utiliza para aumentar clonalmente en los microrreactores el numero de copias de la especie de molde inicial, y estas copias se unen a las perlas de captura de los microrreactores.

Ventajosamente, los microrreactores permiten la amplificación simultanea clonal y discreta de muchos moldes diferentes sin contaminación cruzada de los productos amplificados o de los reactivos., o el dominio de un molde particular o de una serie de moldes (por ejemplo, predisposición de peR) . La reacción de amplificación, por ejemplo, puede ser llevada a cabo simultaneamente con al menos 3.000 microrreactores por microlitro de mezcla de reacción.

preferiblemente, cada microrreactor comprende una o pocas especies de molde amplificado.

Los microrreactores pueden tener un tamano medio de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 250 μm. preferiblemente, los microrreactores tienen un diametro medio de aproximadamente 60 a aproximadamente 200 μm. Mas preferiblemente. los microrreactores tienen un diametro medio de aproximadamente 60 μm tal como una media de 40 μm a 80 μm de diametro. Los microrreactores pueden tener un diametro medio de 60 μm aproximadamente.

preferiblemente, los microrreactores tienen un volumen medio de aproximadamente 113 pl. Lo mas preferible, aproximadamente 3.000 microrreactores... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para enriquecer un amplicón, que comprende:

(a) distribuir una solución que comprende una pluralidad de perlas y una pluralidad de especies de moleculas de acido nucleico de molde, en una pluralidad de gotitas de emulsión acuosa en una fase oleosa termoestable;

en el que un primer subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas y una o mas de las especies de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas, y un segundo subconjunto de las gotitas comprenden una o mas de las perlas sin ninguna de las especies de moleculas de acido nucleico de molde encapsuladas en ellas;

(b) amplificar las especies de moleculas de acido nucleico de molde del primer subconjunto de gotitas, en el 10 que una o mas perlas del primer subconjunto de gotitas acuosas tienen un amplicón inmovilizado en ellas;

(c) romper las gotitas de emulsión acuosa para liberar las perlas del primer y el segundo subconjuntos;

(d) hibridar con el amplicón inmovilizado en las perlas un cebador que es complementario del extremo 3' del amplicón; y o bien:

(e) (i) formar un complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, en el que la perla de enriquecimiento y el cebador hibridado forman un par de captura-diana, y en el que las perlas de enriquecimiento pueden ser aisladas bajo una condición selectiva; y (f) (i) aplicar la condición selectiva para aislar el complejo de perla con amplicón inmovilizado y perla de enriquecimiento, desde las perlas que no tienen amplicón unido; o bien (e) (ii) exponer las perlas con amplicón inmovilizado a una o mas superficies de unión que comprenden restos de captura, cuyos restos de captura forman pares de captura-diana con el cebador hibridado de las perlas con amplicón inmovilizado, y separar las perlas con amplicón inmovilizado desde las perlas que no tienen amplicón unido.

2. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la solución comprende una razón del numero de las moleculas de acido nucleico de molde al numero de las perlas, menor que 1

25 3. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la solución comprende, ademas, una mezcla suficiente de reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación de las especies de moleculas de acido nucleico de molde.

4. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la etapa de amplificación emplea un procedimiento de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa.

30 5. El metodo segun la reivindicación 1, en el que el cebador complementario del extremo 3' del amplicón de la etapa

(d) tiene, al menos, 15 bases.

6. El metodo segun la reivindicación 1, en el que el metodo comprende las etapas (e) (i) y (f) (i) y en el que la condición selectiva comprende un campo magnetico que permite aislar una o mas de las perlas de enriquecimiento desde las perlas del segundo subconjunto.

35 7. El metodo segun la reivindicación 1, que comprende, ademas, determinar una composición de acido nucleico para la una o mas especies de moleculas de acido nucleico de molde.

8, El metodo segun la reivindicación 1, que comprende, ademas, reciclar y reutilizar las perlas del segundo subconjunto.

9. El metodo segun la reivindicación 1, en el que el cebador complementario del extremo 3' del amplicón de la etapa (d) , es un cebador biotinilado que en la etapa (e) (i) o en la etapa (e) (ii) esta inmovilizado por un resto de estreptavidina formando un par de biotina-estreptavidina, de captura-diana.

10. El metodo segun la reivindicación 1, que comprende, ademas, extender el cebador hibridado con el extremo 3' del amplicón de la etapa (d) por adición de DNA polimerasa y de los cuatro desoxinucleótido trifosfatos (dNTps) naturales a la mezcla de perlas, en el que la extensión intensifica la unión entre el cebador y el amplicón 45 inmovilizado en la perla.

11. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la reivindicación 1 comprende la etapa (c) (ii) y en el que el metodo comprende, ademas: verter las perlas del primer y segundo subconjuntos que existen en una solución, sobre la una o mas superficies de unión, en el que las perlas del segundo subconjunto permanecen en la solución 12. El metodo segun la reivindicación 1, en el que la reivindicación 1 comprende las etapas (e) (i) y (f) (i) y en el que el metodo comprende, ademas: separar el cebador desde el amplicón inmovilizado en la perla para separar las perlas de enriquecimiento desde las perlas con amplicón inmovilizado.

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