Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas para los siguientesgenes objetivo que codifican:

a) acetato cinasa,

b) lactato deshidrogenasa,

c) alcohol deshidrogenasa,

d) piruvatoformiatoliasa,

e) metilglioxal sintasa,

f) piruvato oxidasa,

g) citrato liasa,

h) aspartato aminotransferasa,

i)transportador de formiato,

j) fosfato acetiltransferasa,

k) enzima málica, y

l) propionato cinasa/α-cetobutirato-formiatoliasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho genobjetivo.

Materiales y métodos para la producción eficaz de succinato y malato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La producción fermentativa de succinato a partir de materias primas renovables será cada vez más competitiva

conforme aumenten los precios del petróleo. El succinato puede servir como un sustrato para su transformación en plásticos, disolventes y otros productos químicos actualmente hechos del petróleo (Lee et al., 2004; Lee et al., 2005; McKinlay et al., 2007; Wendisch et al., 2006; Zeikus et al., 1999) . Se han descrito muchas bacterias con la capacidad natural de producir succinato como un producto de fermentación principal (patente de EE. UU. Núm. 5.723.322; tabla 1) . Sin embargo, frecuentemente se requieren procesos complejos, medios complejos y tiempos de incubación

largos.

Anteriormente se han usado una variedad de enfoques genéticos para construir por ingeniería cepas de Escherichia coli para la producción de succinato con grados variables de éxito (tabla 1) . En la mayoría de los estudios, los títulos alcanzados fueron bajos, y fueron necesarios ingredientes de medio complejos tales como extracto de levadura o licor de maceración de maíz. La cepa NZN111 produjo succinato 108 mM con un rendimiento molar de 0, 98 moles 15 de succinato por mol de glucosa metabolizada (Chatterjee et al., 2001; Millard et al., 1996; Stols y Donnelly, 1997) . Esta cepa fue construida por ingeniería desactivando dos genes (pflB, que codifica piruvato formiato liasa, e IdhA que codifica lactato deshidrogenasa) , y expresando en exceso dos genes de E. coli, malato deshidrogenasa (mdh) y fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) , de plásmidos multicopia. La cepa HL27659k fue construida por ingeniería mutando los genes de succinato deshidrogenasa (sdhAB) , fosfato acetiltransferasa (pta) , acetato cinasa (ackA) , 20 piruvato oxidasa (poxB) , transportador de glucosa (ptsG) , y el represor de isocitrato liasa (iclR) . Esta cepa produjo succinato menor de 100 mM y requirió condiciones de fermentación de oxígeno limitado (Cox et al., 2006; Lin et al., 2005a, 2005b, 2005c; Yun et al., 2005) . El análisis del metabolismo in silico se ha usado para diseñar genes desactivados para crear una ruta en E. coli análoga a la ruta de succinato nativa en Mannheimia succiniciproducens (Lee et al., 2005 y 2006) . Sin embargo, la cepa resultante produjo muy poco succinato. Andersson y otros (2007)

informaron sobre los valores más altos de producción de succinato (339 mM) por una E. coli construida por ingeniería que contenía solo genes nativos.

Otros investigadores han buscado enfoques alternativos para expresar genes heterólogos en E. coli. La piruvato carboxilasa (pyc) de Rhizobium eteloti fue expresada en exceso a partir de un plásmido multicopia para dirigir el flujo de carbono a succinato (Gokarn et al., 2000; Vemuri et al., 2002a, 2002b) . La cepa SBS550MG se construyó

desactivando el represor de isocitrato liasa (iclR) , adhE, idhA, y ackA, y expresando en exceso citZ (citrato sintasa) de Bacillus subtilis y pyc de R. etli de un plásmido multicopia (Sánchez et al., 2005a) . Con esta cepa se produjo succinato 160 mM a partir de glucosa, con un rendimiento molar de 1, 6.

También se han investigado procesos más complejos para la producción de succinato (tabla 1) . Muchos de estos procesos incluyen una fase de crecimiento aeróbico seguida por una fase de producción anaeróbica. En la fase

anaeróbica se suministra frecuentemente dióxido de carbono, hidrógeno, o ambos (Andersson et al., 2007; Sánchez et al., 2005a y 2005b; Sánchez et al., 2006; patente de los Estados Unidos Núm. 5, 869, 301; Vemuri et al., 2002a y 2002b) . En un estudio reciente con un productor de succinato nativo, A. succiniciproducens, se combinó electrodiálisis, rociado con CO2, reciclado celular, y alimentación por lote (Meynial-Salles et al., 2007) .

La presente invención provee varias formas de microorganismos, tales como cepas de E. coli, que producen

succinato con títulos y rendimientos altos, en medios de sales minerales, durante fermentaciones simples por lote de pH controlado, sin la necesidad de genes heterólogos ni plásmidos. Durante el desarrollo, se caracterizó una cepa intermedia que produjo malato como el producto dominante.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCION

El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones y cualquier información que no se 45 encuentre en las reivindicaciones es proporcionada solamente como información.

La presente invención se refiere a microorganismos novedosos útiles en la producción de ácido láctico, por ejemplo Escherichia coli. Por consiguiente, los materiales y métodos de la presente invención se pueden usar para producir succinato y malato para usarse en una variedad de aplicaciones.

En algunos aspectos de la descripción, se pueden usar derivados de Escherichia coli (también referida aquí como E.

50 coli) para la construcción de cepas que producen succinato, malato y alanina. En varios aspectos se puede usar E. coli C (por ejemplo, ATCC 8739) , como se puede usar cualquier otra cepa de E. coli que se pueda obtener de diversos depósitos o fuentes comerciales. También, en algunos aspectos, los microbios de la descripción construidos por ingeniería contienen solo genes nativos (esto es, no contienen material genético de otros organismos) . De la siguiente descripción se harán muy evidentes ventajas adicionales de esta exposición.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figuras 1A-1B. Fermentación de glucosa a succinato. La figura 1A muestra la ruta estándar de fermentación de glucosa en E. coli. Esta ruta ha sido modificada de Unden y Kleefeld (2004) . Las flechas en negrita representan las rutas fermentativas centrales. Las cruces representan las supresiones de genes realizadas en este estudio para construir KJ012 (idhA, adhE, ackA) . Genes y enzimas: IdhA, lactato deshidrogenasa; pflB, piruvato-formiato liasa; focA, transportador de formiato; pta, fosfato acetil transferasa; ackA, acetato cinasa; adhE, alcohol deshidrogenasa; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilasa; pdh, complejo de piruvato deshidrogenasa; gltA, citrato sintasa; mdh, malato deshidrogenasa; fumA, fumB, y fumC, isoenzimas fumarasas; frdABCD, fumarato reductasa; fdh, formiato deshidrogenasa; icd, isocitrato deshidrogenasa; acs, acetilºCoA sintetasa; mgsA, metilglioxal sintasa; poxB, piruvato oxidasa; aldA, aldehído deshidrogenasa; y aldB, aldehído deshidrogenasa. La figura 1B muestra el acoplamiento de la producción de ATP y el crecimiento con la producción de succinato y malato en cepas de E. coli construidas por ingeniería. Las flechas continuas conectan las reservas de NADH. Las flechas de puntos conectan las reservas de NAD+. Durante la glicólisis bajo condiciones anaeróbicas, el crecimiento está acoplado obligadamente con la producción de ATP y la oxidación de NADH.

Figuras 2A-2D. Rutas potenciales de carboxilación para la producción de succinato en E. coli. Los genes que codifican las enzimas clave de carboxilación se muestran en letra negrita. La figura 2A muestra la PEP carboxilasa. No se produce ATP de fosfoenolpiruvato (PEP) . Esta es considerada como la ruta principal para la producción de succinato en E. coli durante la fermentación de glucosa.

La figura 2B muestra la enzima málica (NADH) . La energía se conserva durante la producción de ATP a partir de ADP y PEP por medio de piruvato cinasa (pykA o pykF) . La enzima málica (sfcA) cataliza una carboxilación reductiva conectada con NADH para producir malato. La figura 2C muestra la enzima málica (NADPH) . La energía se conserva durante la producción de ATP a partir de ADP y PEP por medio de piruvato cinasa (pykA o pykF) . La enzima málica (maeB) cataliza una carboxilación reductiva conectada con NADPH para producir malato. La figura 2D muestra la PEP carboxi cinasa. La energía se conserva por la producción de ATP durante la carboxilación de PEP para producir ácido oxaloacético.

Figuras 3A-3C. Crecimiento durante la evolución metabólica de KJ012 para producir KJ017, KJ032, y KJ060. La cepa KJ012 se transfirió secuencialmente en medio NBS que contenía 5% de glucosa (p/v) (figura 3A) y 10% de glucosa (p/v) (figura 3B) , respectivamente, para producir KJ017. Después de la supresión de focA y pflB, la cepa resultante (KJ032) se sub-cultivó inicialmente en medio con un suplemento de acetato (figura 3C) . Los niveles de... [Seguir leyendo]

1. Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas para los siguientes genes objetivo que codifican: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol deshidrogenasa, d) piruvatoformiato liasa, e) metilglioxal sintasa, f) piruvato oxidasa, g) citrato liasa, h) aspartato aminotransferasa, i) transportador de formiato, j) fosfato acetiltransferasa, k) enzima málica, y l) propionato cinasa/a-cetobutirato-formiato liasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho gen objetivo.

2. La cepa bacteriana modificada genéticamente de la reivindicación 1, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es: Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Cor y nebacterium acetophilum, Cor y nebacterium glutamicum, Cor y nebacterium callunae, Cor y nebacterium acetoacidophilum, Cor y nebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chr y santhemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus er y thropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, o Xanthomonas citri.

3. La cepa bacteriana modificada genéticamente de la reivindicación 2, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es Escherichia coli.

4. La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el gen, o porciones del mismo o los genes objetivo, o las porciones de los mismos, son anulados por deleciones, mutaciones de desplazamiento de marco, mutaciones puntuales, la inserción de codones de detención o combinaciones de los mismos.

5. La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente no contiene un gen exógeno ni un fragmento del mismo, o solo contiene genes nativos.

6. La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con la condición de que: 1) dicha cepa bacteriana modificada genéticamente no debe tener uno o más de las siguientes enzimas desactivadas: a) fumarato reductasa b) ATP sintasa; c) 2-cetoglutarato deshidrogenasa; d) succinato deshidrogenasa; e) transportador de glucosa; f) represor de isocitrato liasa; y/o 2) dicha cepa modificada genéticamente no contenga un plásmido o un plásmido multicopia que codifique y/o exprese en exceso los genes para la malato deshidrogenasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, piruvato carboxilasa, y/o citrato sintasa.

7. La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente está evolucionada metabólicamente.

8. La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce:

a) concentraciones de succinato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM; b) concentraciones de fumarato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM; o c) concentraciones de malato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM.

9. Una cepa bacteriana modificada genéticamente, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es KJ134 depositada en la Colección de Cultivos ARS con la designación de cepa B50116.

10. Un método de cultivo o desarrollo de una cepa bacteriana modificada genéticamente, que comprende inocular un medio de cultivo con una o más de las cepas bacterianas modificadas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y cultivar o desarrollar dicha cepa bacteriana modificada genéticamente.

11. El método de la reivindicación 10, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente se cultiva en un medio de sales minerales, preferiblemente en un medio que comprende entre 2% y 20% de carbohidrato (p/v) , más preferiblemente en un medio que contiene 2%, 2, 5%, 3%, 3, 5%, 4%, 4, 5%, 5%, 5, 5%, 6%, 6, 5%, 7%, 7, 5%, 8%, 8, 5%, 9%, 9, 5%, 10%, 10, 5%, 11%, 11, 5%, 12%, 12, 5%, 13%, 13, 5%, 14%, 14, 5%, 15%, 15, 5%, 16%, 16, 5%, 17%, 17, 5%, 18%, 18, 5%, 19%, 19, 5%, o 20% de un azúcar (p/v) , siendo preferiblemente dicho carbohidrato glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosa, o combinaciones de las mismas.

12. Un método para producir succinato, fumarato o malato que comprende cultivar una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones que permitan la producción de succinato o malato o fumarato

13. El método de la reivindicación 12, donde dicha una o más cepa bacteriana modificada genéticamente es KJ134 depositada en la Colección de Cultivos ARS con la designación de cepa B50116.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente se cultiva en un medio de sales minerales, preferiblemente en un medio que comprende entre 2% y 20% de carbohidrato (p/v) , más preferiblemente en un medio que contiene 2%, 2, 5%, 3%, 3, 5%, 4%, 4, 5%, 5%, 5, 5%, 6%, 6, 5%, 7%, 7, 5%, 8%, 8, 5%, 9%, 9, 5%, 10%, 10, 5%, 11%, 11, 5%, 12%, 12, 5%, 13%, 13, 5%, 14%, 14, 5%, 15%, 15, 5%, 16%, 16, 5%, 17%, 17, 5%, 18%, 18, 5%, 19%, 19, 5%, o 20% de un azúcar (p/v) , siendo preferiblemente dicho carbohidrato glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosa, o combinaciones de las mismas.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde el rendimiento de succinato o malato es mayor

o igual que 90%, más preferiblemente un rendimiento de al menos 90%, 90, 5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92, 5%, 93%, 93, 5%, 94%, 94, 5%, 95%, 95, 5%, 96%, 96, 5%, 97%, 97, 5%, 98%, 98, 5%, o 99%,

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce

a) concentraciones de succinato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM, b) concentraciones de malato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM, o c) concentraciones de fumarato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, donde el medio de crecimiento comprende glicerol como sustrato para la producción de succinato, malato o fumarato.

18. Una composición que comprende una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un medio.