Lipasa LipBL y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere al uso de la lipasa LipBL para la hidrólisis de distintos sustratos seleccionados de entre p-nitrofenoles,

tributirina, Tween 80, aceites, sustratos quirales y proquirales, aceite de pescado, azúcares paracetilados o nitrocefin y a un procedimiento enzimático de monodesprotección regioselectiva de azúcares paracetilados para la obtención de azúcares monodesacteilados.

LlPASA LlPBL Y SUS APLICACIONES

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se encuadra de forma general en el campo de la microbiología enzimática y más en particular se refiere a biocatalizadores químicos, farmacéuticos o alimentarios.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las lipasas constituyen el grupo de biocatalizadores más importante por sus aplicaciones biotecnológicas. Las razones de este enorme potencial biotecnológico de las lipasas microbianas se debe a que son estables en disolventes orgánicos, no requieren cofactores, poseen un amplio rango de especificidad de sustrato y presentan una alta enantioselectividad (Jaeger y Reetz, 1998, Trends Biotechnol, 16: 396-403) . Además, pueden ser producidas en grandes cantidades, ya que la mayoría se obtienen con gran rendimiento de microorganismos tales como hongos o bacterias (Jaeger y Eggert, 2002, Curr Opin Biotechnol., 13: 390-397) .

La utilización de lipasas como catalizadores en numerosos procesos industriales está cada día más extendida, ya que presenta una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos (Arroyo, 1998, Ars Pharm 39: 23-39) : poseen una gran actividad catalítica, muestran una gran especificidad de sustrato, son muy activas a temperatura ambiente y presión atmosférica. Sin embargo, determinados factores como, el hecho de que la mayoría de las lipasas no son estables en las condiciones de trabajo y son difícilmente reutilizables, han contribuido a que su uso industrial no se haya generalizado.

La inmovilización de estas enzimas ha ayudado a superar estos inconvenientes, llevándose a cabo un proceso mediante el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte (Taylor, 1991, Marcel Dekker) . La unión a soportes es el método de inmovilización más utilizado. La elección del soporte y del tipo de enlace es fundamental en el comportamiento posterior del biocatalizador. Los soportes de naturaleza hidrofóbica, se utilizan además de para inmovilizar lipasas, para la purificación de las mismas aprovechando el distinto comportamiento que muestran éstas hacia los diferentes soportes de esta naturaleza. Hasta el momento, hay una gran cantidad de soportes de diferente naturaleza descritos para la inmovilización de estas enzimas: por ejemplo, para la mejora de sus propiedades, la lipasa de Penicillium simplicissimum fue inmovilizada en soportes hidrofóbicos (unión reversible) (Cunha y coL, 2009, Appl Biochem BiotechnoL , 156: 133-145) , otra lipasa descrita como la de Bacillus thermocatenulatus, se inmovilizó en el soporte glioxyl agarosa para aumentar su estabilidad debido a que en este soporte la unión es covalente y la estructura de la enzima fijada a él es más rígida (Fernández-Lorente y coL, 2008, Biomacromolecules 9: 2553-2561) Y otras lipasas descritas como la de Yarrowia lipolytica se inmovilizó a soportes de diferentes características para estudiar su comportamiento en cada uno de ellos (Cunha y coL, 2008, Appl Biochem Biotechnol. ,

146: 49-56) .

En cuanto a los métodos de purificación de estas enzimas, existen múltiples procesos dependiendo si la purificación se realiza desde el microorganismo original que las produce como es el caso de las lipasas de Staphylococcus warneri (Volpato y coL, 2010, J Chromatogr A. 1217: 473-478) y de Penicillium simplicissimum (Cuhna, y coL, 2009, Appl Biochem BiotechnoL , 156: 133-145) , si se realiza desde Escherichia coli por clonación del gen que codifica la proteína en vectores de expresión como pBC o pKS como es el caso de la penicilin G acilasa (Fuentes y coL, 2007, Biomacromolecules., 8: 703-707.) , o si se realiza desde E. coli por clonación del gen en un vector inducible que le añade a la proteína colas de polihistidinas, en cuyo caso, la purificación es bastante más sencilla como es el caso de numerosas enzimas como la lipasa de Clonorchis sinensis (Hu y coL, 2009, Zhongguo., 27: 95-101) .

Los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (PUFAs) desempeñan funciones muy importantes en la gestación, lactancia e infancia ya que son constituyentes de los fosfolípidos de las membranas celulares y forman parte de las estructuras neuronales. Estos ácidos grasos esenciales tienen muchos efectos beneficiosos en el organismo: son importantes para mantener la estructura y la función de la membrana celular y las membranas subcelulares, para producir las prostaglandinas que regulan procesos como la inflamación y la coagulación, para un correcto desarrollo de vasos sanguíneos y nervios y además mantienen la piel y otros tejidos jóvenes y flexibles debido a su capacidad lubricante (O'Keefe, 2002, Akoh CA, Min OB (eds) Marcel Oekker Ud, NY, pp: 1-40) . Debido a sus propiedades antiinflamatorias, los PUFAs podrían contribuir a mejorar los síntomas en enfermedades como la artritis reumatoide, o el asma (Wijendran y Hayes, 2004, Annu Rev Nutr., 24: 597-615) . Además, existen algunos estudios que indican que los PUFAs podrían prevenir o reducir la progresión de ciertos tipos de cáncer (Simopoulos, 2002, J Am ColI Nutr., 21: 495-505; Oh Y coL, 2005, Cancer Epidemiol. Biomarkers 14: 835-841) .

Las principales fuentes de EPA (ácido eicosapentaenoico) y DHA (ácido docosahexaenoico) son los aceites de pescado obtenidos habitualmente como subproducto del procesamiento del mismo (Schmitt-Rozieres y coL, 2000, JAOCS., 77: 329-332) . Estos aceites contienen alrededor de un 30% de PUFAs omega-3 combinados con diferentes ácidos grasos, principalmente en forma de triglicéridos.

Se han desarrollado varios métodos para la purificación de PUFAs a partir de este tipo de aceites mediante métodos químicos o métodos enzimáticos (Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240) . En cuanto a los métodos químicos, mediante cromatografía es posible separar ácidos grasos en función de su número de átomos de carbono así como del grado de insaturaciones que posean, utilizando HPLC o cromatografía con resina de plata (Robles Medina y coL, 1998, Biotechnol. Adv. 16: 517-580; Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240) . La destilación molecular se ha utilizado para la separación parcial de mezclas de ésteres de ácidos grasos. Este método tiene la ventaja de las diferencias en el punto de ebullición y el peso molecular de estas moléculas bajo una presión reducida (0, 1-1, 0 mmHg) . Un inconveniente que presenta esta metodología es que se requieren elevadas temperaturas (250ºC) que favorecen la oxidación, polimerización e isomerización de los dobles enlaces presentes en estos ácidos grasos (Rosu Y col., 1998, J. Mol. Catal. B., 4: 191-198; Shahidi yWanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240) . Por este motivo, los triglicéridos son transformados en etil o metil ésteres que tienen puntos de ebullición más bajos y pueden ser separados más fácilmente por destilación en vacío. La principal desventaja de este método es el uso de grandes cantidades de disolventes tanto para la reacción como para la separación de los productos.

Otros métodos químicos para concentrar PUFAs omega-3 son la cristalización a baja temperatura y la formación de complejos con urea (Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240; Robles Medina y coL, 1998, Biotechnol. Adv.

16: 517-580) . El primero se basa en las diferencias de solubilidad de las grasas en disolventes orgánicos. Esta solubilidad disminuye cuando se incrementa el peso molecular y aumenta cuando el número de insaturaciones es mayor. Por otro lado, los ácidos grasos saturados de seis o más átomos de carbono forman complejos con urea que precipitan. La formación de estos complejos se dificulta cuando se incrementan el número de insaturaciones presentes en la molécula (Shahidi y Wanasundara, 1998, Trends Food Sci. Technol., 9: 230-240) .

Por otro lado, en cuanto a los métodos enzimáticos, en los últimos años diversos investigadores han utilizado lipasas de origen microbiano para producir concentrados de PUFAs omega-3 a partir de la hidrólisis de aceites de pescado. En función del tipo de microorganismos del que proceden, existen lipasas que muestran preferencia por los ésteres de DHA frente a los ésteres de EPA y viceversa (Okada y Morrissey, 2008, J Food Sci., 73: 146-50) .

El principal inconveniente del método enzimático es que la actividad de las lipasas microbianas frente a los ésteres de ácidos grasos poliinsaturados es baja debido a los impedimentos estéricos derivados de la estructura de esas...

1. Uso de la lipasa LipBL para la hidrólisis de sustratos seleccionados de entre pnitrofenoles, tributirina, Tween 80, aceites, sustratos quirales y proquirales, aceite de pescado, azúcares paracetilados o nitrocefin.

2. Uso de la lipasa LipBL según la reivindicación 1, donde la lipasa LipBL se encuentra unida a un soporte.

3. Uso de la lipasa LipBL según la reivindicación 2, donde el soporte es seleccionado de entre octil agarosa, dextrano sulfato, glioxil agarosa, aminoglioxil o bromocianógeno.

4. Uso de la LipBL según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el sustrato es un p-nitrofenol seleccionado de entre acetato, butirato, octanoato, decanoato, laurato, miristato o palmitato.

5. Uso de la lipasa LipBL según las reivindicaciones 1-3, donde los sustratos quirales y proquirales son seleccionados de entre dimetil 3-fenil glutarato, metil 3-fenil glutarato, madelato de metilo, ácido 2-0-butiroil mandélico, 4-fenil-2-hidroxietilbutirato o hexaacetil lactal.

6. Uso de la lipasa LipBL según las reivindicaciones 1-3, para la hidrólisis de sustratos beta-Iactámicos

7. Uso de la lipasa LipBL según la reivindicación 6, donde el sustrato beta-Iactámico es nitrocefin.

8. Uso de la lipasa LipBL según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la lipasa es activa en un rango de temperatura comprendido entre 5-90ºC.

9. Uso de la lipasa LipBL según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la lipasa LipBL es activa a pH comprendidos entre 4-9.

10. Uso de la lipasa LipBL según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la lipasa LipBL es activa en un rango salino comprendido entre 0-3 M de NaCl.

11. Uso de la lipasa LipBL según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la monodesprotección regioselectiva de azúcares peracetilados.

12. Uso de la lipasa LipBL según la reivindicación 1, para la obtención de azúcares

monodesacteilados a partir de la monodesprotección regioselectiva de azúcares 5 peracetilados

13. Uso según la reivindicación 12, donde el azúcar peracetilado es un disacárido peracetilado.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, donde el azúcar peracetilado es el hexaacetillactal.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde el azúcar monodesacetilado obtenido es el 3, 6, 2', 3'.

4. penta-Q-acetil lactal.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12-15, donde la lipasa está unida a un soporte seleccionado de entre octil agarosa, dextrano sulfato, glioxil agarosa, aminoglioxil o bromocianógeno.

17. Kit que comprende la lipasa LipBL para la obtención de azúcares monodesacetilados a partir de la monodesprotección regioselectiva de azúcares peracetilados según las reivindicaciones 12-16.