GEN DE RESISTENCIA DERIVADO DE PLANTA.

Molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que puede conferir resistencia frente a un patógeno en una planta en la que dicho polipéptido se expresa,

comprendiendo o consistiendo dicha molécula de ácido nucleico en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos la forma madura de una proteína (R1) que comprende la secuencia de aminoácidos facilitada en SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de nucleótidos que comprende las regiones codificantes de la secuencia de ADN facilitada en SEQ ID NO: 1;

(c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos definida en (a) o (b) en condiciones de hibridación rigurosas, en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b);

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína derivada de la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de (a) o (b) por medio de sustitución, deleción y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b);

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 60% a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a) o (b);

(f) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos un dominio de cremallera de leucina (LZ) correspondiente a la posición de aminoácidos 308-329 de SEQ ID NO: 2, un dominio de sitio de unión a ácido nucleico (NBS) correspondiente a la posición de aminoácidos 572-682 de SEQ ID NO: 2 y/o un dominio de repetición rica en leucina (LRR) correspondiente a la posición de aminoácidos 780- 1280 de SEQ ID NO: 2;

(g) una secuencia de nucleótidos que codifica para una parte que lleva un epítopo de una proteína (R1) codificada por una secuencia de nucleótidos de (a) o (b), en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b);

(h) cuya secuencia de nucleótidos está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) a (g), en la que dicho patógeno se selecciona del grupo que consiste en Phytophthora sojae, Peronospora parasitic, Magnaporthe grisea, Erysiphe spp, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Pythium debaryanum y Phytophthora infestans.

Gen de resistencia derivado de planta La presente invención se refiere al gen de resistencia R1 de la patata. Se refiere además a métodos y materiales que emplean el gen, y a procedimientos para identificar o producir otros genes relacionados. También se refiere generalmente a métodos para identificar agentes protectores de plantas que pueden inducir el gen R1 o la actividad de su proteína codificada. Además, la presente invención se refiere a plantas transgénicas que se hicieron resistentes a tizón tardío debido a la expresión de un transgén R1.

Se citan varios documentos a lo largo de todo el texto de esta memoria descriptiva por el nombre. Pueden encontrarse las citas bibliográficas completas al final de la memoria descriptiva, precediendo inmediatamente a la lista de secuencias o las reivindicaciones.

El tizón tardío es a nivel mundial la enfermedad más destructora para el cultivo de patata provocando pérdidas de miles de millones de dólares cada año (Kamoun et al. 1999) . El patógeno causante es Phytophthora infestans, un hongo oomiceto que también infecta los tomates (Judelson 1997) . La destrucción completa del cultivo de patata por el tizón tardío provocó la "hambruna irlandesa de la patata" a mediados del siglo XIX (Salaman 1985) e inició la búsqueda de plantas resistentes. Se descubrieron genes individuales para la resistencia al tizón tardío (genes R) hace casi 100 años en S. demissum, una especie de patata silvestre autóctona de México. La introgresión en cultivares de patata de genes R que confieren resistencia específica de la variedad proporcionó, sin embargo, sólo una resistencia transitoria al tizón tardío, ya que las nuevas variedades superaron rápidamente la resistencia mediada por genes R (Wastie 1991, Fr y y Goodwin 1997) . También se ha identificado resistencia cuantitativa o de campo al tizón tardío en especies de patata silvestres (Ross 1986) . Esta resistencia es más duradera que la medida por genes R, pero difícil de mover en variedades cultivadas mediante cruzamiento y selección fenotípica. El tizón tardío se controla todavía en su mayor parte por la aplicación frecuente de fungicidas que pierden eficacia por la selección de aislados resistentes a los fungicidas.

Varios genes R se han mapeado en cromosomas de patata usando marcadores de ADN (Leonards-Schippers et al. 1992, El-Kharbotly et al. 1994, 1996, Li et al. 1998, Ewing et al. 2000, Naess et al. 2000) . R1 está ubicado en el cromosoma V (Leonards-Schippers et al. 1992) en una región en la que también se han mapeado genes para la resistencia al virus X de la patata (Ritter et al. 1991, De Jong 1997) . La misma región contiene loci de rasgos cuantitativos (LRC) principales para la resistencia al nematodo quístico parasitario de la raíz Globodera pallida (Kreike et al. 1994, Rouppe van der Voort et al. 1997, 2000) y tizón tardío (Leonards-Schippers et al. 1994, Oberhagemann et al. 1999, Collins 1999) . La presencia de un punto caliente de genes de resistencia sugiere su evolución a partir de ancestros comunes mediante duplicación génica local seguida por diversificación funcional (Leonards-Schippers et al. 1994, Leister et al. 1996, Oberhagemann et al. 1999, Gebhardt y Valkonen 2001) . Si este es el caso, la clonación molecular del gen R1 debería abrir la posibilidad de estudiar a nivel molecular varios factores que se mapean en la región y que participan en el control de la resistencia cualitativa y cuantitativa a diversos patógenos.

Por tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención era cumplir con la necesidad de genes de resistencia a patógenos de plantas y sus secuencias reguladoras. Se logra la solución al problema técnico proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y descritas adicionalmente a continuación.

Según la presente invención, se ha clonado y caracterizado a nivel molecular R1, el cebador gen para la resistencia al tizón tardío. Se identificó el gen mediante un enfoque combinado particular de clonación posicional y gen candidato. La estructura molecular del gen permite clasificar R1 entre los genes de resistencia de plantas que contienen motivos de cremallera de leucina y NBS-LRR conservados (Ellis et al. 2000, Dangl y Jones, 2001) .

R1 se clonó usando una estrategia clonación posicional en combinación con la búsqueda de genes candidatos que tienen una similitud de secuencia de ADN con genes de resistencia de plantas conocidos (Hammond-Kosack y Jones 1997, Ellis et al. 2000) . Un enfoque similar fue satisfactorio para la clonación de genes de la patata para la resistencia al virus X de la patata (Rx1, Bendahmane et al. 1999) y el nematodo quístico de la raíz Globodera pallida (Gpa2, Van der Vossen et al. 2000) . Se inició un paseo cromosómico hacia R1 desde dos loci marcadores SPUD237 y AFLP1, que flanquean R1 a cortas distancias genéticas de 0, 1 cM. El paseo desde el marcador AFLP1 demostró ser improductivo, sin embargo, debido a la escasez de clones BAC y YAC (Leister et al. 1997) que tienen el marcador AFLP1. La identificación de clones genómicos de patata con insertos solapantes se facilitó mediante la tecnología BAC en combinación con el uso de macromatrices de clones BAC. La aplicación de este enfoque fue satisfactoria en el arroz (Nakamura et al. 1997, Yang et al. 1997, Yang et al. 1998) y el tomate (Folkertsma et al. 1998) . El mapa físico (figura 1) cubre al menos 250 kb del genoma de la patata. Aproximadamente 200 kb era una región candidata a contener el gen R1 basado en ligamiento sin recombinación a marcadores de extremo BAC. La región candidata estaba abierta por los extremos hacia el locus AFLP1 porque no se incluyó el acontecimiento de recombinación individual que separa R1 y AFLP1 en el mapa físico. La información de secuencia parcial de la región candidata identificó un fragmento génico similar al gen de resistencia RGL que detectó una familia de genes con miembros presentes en ambos cromosomas que llevan el alelo de susceptibilidad r1 o el alelo de resistencia R1. De hecho, la sonda RGL usada para identificar ADNc y clones BAC para R1 era parte de un alelo de susceptibilidad r1. Basándose en un ensayo de PCR específico de

alelo derivado de un clon de ADNc que codifica para parte de R1, se demostró que estaba presente un miembro funcional de la familia de genes candidatos en plantas que tenían el alelo de resistencia R1 y que estaba ausente en plantas susceptibles. Este gen candidato se subclonó a partir de BAC BA87d17 y se transformó de manera estable en el cultivar susceptible Desirée. La complementación del fenotipo R1 en varias plantas transgénicas mostró que el gen candidato era, en efecto, el gen R1.

Las realizaciones de la invención se definen por las reivindicaciones.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que puede conferir resistencia frente a un patógeno en una planta en la que se expresa dicho polipéptido, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico o consistiendo en una secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos la forma madura de una proteína (R1) que comprende la secuencia de aminoácidos facilitada en SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de nucleótidos que comprende las regiones codificantes de la secuencia de ADN facilitada en SEQ ID NO: 1;

(c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos definida en (a) o (b) en condiciones de hibridación rigurosas, en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) ;

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína derivada de la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de (a) o (b) por medio de sustitución, deleción y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a)

o (b) , en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) ;

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 60% a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a) o (b) ;

(f) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos un dominio de cremallera de leucina (LZ, leucine zipper) correspondiente a la posición de aminoácidos 308-329 de SEQ ID NO: 2, un dominio de sitio de unión a ácido nucleico (NBS, nucleic binding... [Seguir leyendo]

1 Molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que puede conferir resistencia frente a un patógeno en una planta en la que dicho polipéptido se expresa, comprendiendo o consistiendo dicha molécula de ácido nucleico en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos la forma madura de una proteína (R1) que comprende la secuencia de aminoácidos facilitada en SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de nucleótidos que comprende las regiones codificantes de la secuencia de ADN facilitada en SEQ ID NO: 1;

(c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos definida en (a) o (b) en condiciones de hibridación rigurosas, en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) ;

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína derivada de la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de (a) o (b) por medio de sustitución, deleción y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a)

o (b) , en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) ;

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 60% a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a) o (b) ;

(f) una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos un dominio de cremallera de leucina (LZ) correspondiente a la posición de aminoácido.

30. 329 de SEQ ID NO: 2, un dominio de sitio de unión a ácido nucleico (NBS) correspondiente a la posición de aminoácido.

57. 682 de SEQ ID NO: 2 y/o un dominio de repetición rica en leucina (LRR) correspondiente a la posición de aminoácidos 7801280 de SEQ ID NO: 2;

(g) una secuencia de nucleótidos que codifica para una parte que lleva un epítopo de una proteína (R1) codificada por una secuencia de nucleótidos de (a) o (b) , en la que dicha secuencia de nucleótidos es homóloga en al menos el 80% con las secuencias de nucleótidos de (a) o (b) ;

(h) cuya secuencia de nucleótidos está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) a (g) ,

en la que dicho patógeno se selecciona del grupo que consiste en Phytophthora sojae, Peronospora parasitic, Magnaporthe grisea, Er y siphe spp, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Botr y tis cinerea, Rhizoctonia solani, Pythium debar y anum y Phytophthora infestans.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicho patógeno es Phytophthora infestans.

3. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2.

4. Vector según la reivindicación 3, que es un vector de expresión en el que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a una o más secuencias de control que permiten la transcripción y opcionalmente la expresión en células huésped procariotas y/o eucariotas.

5. Célula huésped que contiene un vector según la reivindicación 3 ó 4 o molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2.

6. Proteína o fragmento funcional de la misma que puede conferir resistencia frente a un patógeno en una planta en la que se expresa, codificada por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2.

7. Anticuerpo o aptámero que reconoce específicamente la proteína según la reivindicación 6.

8. Célula vegetal transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 que está operativamente unida a elementos reguladores que permiten la transcripción y/o expresión de la secuencia de ADN en células vegetales.

9. Planta transgénica o tejido vegetal que comprende células vegetales según la reivindicación 8.

10. Secuencia reguladora de un promotor que regula la expresión de un gen que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, pudiendo conferir o modular dicha secuencia reguladora la expresión de una secuencia de ADN heteróloga tras la infección con patógenos y comprendiendo la secuencia de ADN de SEQ ID NO.1 desde los nucleótidos 1 hasta 2222 o desde los nucleótidos 1 hasta 2164.

11. Molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia reguladora según la reivindicación 10.

12. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 11, en la que dicha secuencia reguladora está operativamente unida a una secuencia de ADN heteróloga.

13. Célula huésped transformada con una secuencia reguladora según la reivindicación 10 o con una molécula de 5 ADN recombinante según la reivindicación 11 ó 12.

14. Planta transgénica, tejido vegetal o célula vegetal que comprende la secuencia reguladora según la reivindicación 10 o la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 11 ó 12.

15. Método para la identificación de un agente protector de plantas que comprende las etapas de:

(a) cultivar un tejido o célula vegetal o mantener una planta que comprende una molécula de ADN

recombinante que comprende un sistema de lectura operativamente unida a una secuencia reguladora según la reivindicación 10 en presencia de un compuesto o una muestra que comprende una pluralidad de compuestos en condiciones que permiten la expresión de dicho sistema de lectura;

(b) identificar o verificar una muestra y compuesto, respectivamente, que conduce a la supresión o activación y/o potenciación de la expresión de dicho sistema de lectura en dicha planta, célula vegetal 15 o tejido vegetal.

16. Método para identificar y obtener un factor de avirulencia o de virulencia de un patógeno que comprende las etapas de:

(a) examinar la proteína R1 según la reivindicación 6 o un fragmento de la misma frente a una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas derivada de un patógeno en un sistema de lectura en condiciones adecuadas que permiten la interacción de la proteína y el péptido en dicho sistema de lectura;

(b) identificar o verificar un ADNc que conduce a la supresión o activación del sistema de lectura.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. KWS Saat AG

<120> Gen de resistencia derivado de planta <130> F 2298 PCT

<150> EP 01120670.3

<151>

<160> 12

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 10388

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> Intrón <222> (4878) .. (4970)

<223>

<220>

<221> Intrón <222> (6103) .. (6229)

<223>

<220>

<221> Intrón <222> (6323) .. (6404)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (2223) .. (4877)

<223>

<220>

<221> *CDS

<222> (4971) .. (6102)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (6230) .. (6321)

<223>

<220>

<221> 5'-UTR

<222> (2164) .. (2222)

<223>

<220>

<221> promotor <222> (1) .. (2164)

<223>

<220>

<221> 3'-UTR

<222> (6405) .. (6702)

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 1293

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido <400> 3

<210> 4

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido <400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido <400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido <400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido <400> 7

<210> 8

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido <400> 8

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Dominio conservado <400> 9

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Dominio conservado <400> 10

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Dominio conservado <400> 11

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Dominio conservado <400> 12