Un procedimiento para variantes de ingeniería de proteínas de una proteína parental que combinamutaciones en dos o más sitios de interés;

el procedimiento comprende las etapas de:

a) proporcionar una proteína parental y una biblioteca de evaluación de sitio de variantes de proteína de dichaproteína parental, donde la biblioteca de evaluación de sitio comprende variantes de la proteína parental modificadacada una en uno de los dos o más sitios de interés;

b) comprobar dicha biblioteca de variantes de proteína y dicha proteína parental para al menos dos propiedades deinterés en las respectivas pruebas de interés;

c) determinar un valor índice de rendimiento para cada propiedad de interés dividiendo el valor obtenido para cadauna de las variantes de proteína entre el valor obtenido para dicha proteína parental en la prueba de interés paraproporcionan una diferencia de energía libre aparente (ΔΔGapp) para cada una de las variantes de proteínacomparado con dicha proteína parental en la prueba de interés.

d) determinar un valor índice de rendimiento previsto para variantes de proteína que combinan mutaciones a dos omás sitios de interés, en el que el valor índice de rendimiento previsto para las variantes que combinan dos o másmutaciones se obtienen añadiendo los valores de ΔΔGapp de estas mutaciones.

e) identificar a partir del valor índice de rendimiento previsto obtenido en la etapa (d) las variantes de proteína quecombinan dos o más mutaciones y que poseen una primera propiedad mejorada con respecto a la proteína parentaly una segunda propiedad que es al menos el 90% de la de la proteína parental, proporcionando de este modo unabiblioteca de variantes de proteína enriquecida en miembros que tienen al menos dos de las propiedades de interés.

Evaluación sistemática de las relaciones entre secuencia y actividad usando bibliotecas de evaluación de sitios para la ingeniería de propiedades múltiples.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos para la ingeniería de proteínas. Específicamente, la invención proporciona procedimientos que utilizan bibliotecas de evaluación de sitios.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los expertos en la técnica conocen diversos procedimientos de ingeniería de proteínas. En general, las proteínas se modifican para obtener propiedades proteicas deseadas. En la mayoría de los procedimientos, la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una proteína está mutada y el gen modificado se expresa para producir mutantes, que se analizan en búsqueda de actividades de interés. A menudo, las propiedades mutantes se comparan con las propiedades de la proteína natural.

Históricamente, el proceso de diseño de proteínas se ha enfocado como equivalente al problema de encontrar en todo el espacio de la proteína la mejor secuencia para la aplicación deseada. Este problema es extremadamente difícil y es “NP complejo”. En la teoría de la complejidad, los problemas definidos como pertenecientes a la clase P se consideran algoritmos de tiempo polinomial fáciles y eficaces para los que existe solución. Los problemas NP complejos son problemas para los que actualmente no se conocen algoritmos de tiempo polinomial eficaces y si pudiera resolverse cualquier problema NP complejo, todos los problemas NP complejos podrían resolverse (Véase, p. ej., Pierce y Winfree, Protein Engineer, 15:779-782 [2002]) . Las estrategias actuales para construir y analizar bibliotecas generalmente implican la generación de diversidad de secuencia de proteína de forma aleatoria a lo largo de la secuencia completa o de forma controlada al azar en posiciones definidas dentro de la proteína. Estas bibliotecas generalmente tienen un gran número de miembros que son “negativos” con respecto a la propiedad principal de interés, y requieren que se analicen cantidades grandes para encontrar un número relativamente pequeño de mutaciones positivas. Generalmente, las mutaciones negativas se ignoran y se obtiene solo la información de secuencia de los miembros positivos.

La mutagénesis de saturación (Estell y col., en World Biotech Report 1984, vol. 2: USA, Online Publications, Londres [1984], páginas 181-187 y Wells y col., Gene 34:315-323 [1985]) es una técnica que puede usarse para busca el espacio en la proteína para mutaciones que optimicen varias propiedades de una proteína. Varios grupos han desarrollado estrategias para identificar sitios que se pueden cambiar mediante mutagénesis de saturación (Reetz y col., Angew. Chem. Int. Edn., 44:4192-4196 [2005]; Kato y col., J. Mol. Biol., 351:683-692 [2005] y Sandberg y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:8367-8371 [1993]) , aunque no se ha propuesto un sistema general para la identificación de sitios.

Además, debido a que la mayoría de los procedimientos de ingeniería de proteínas produce un número mayor de opciones de mutación de aminoácidos, generalmente se requiere una selección de un gran número de variantes para producir una propiedad proteica deseada. Generalmente, la selección se repite una y otra vez para obtener una variante beneficiosa. Por tanto, la mayoría de los procedimientos son laboriosos y llevan mucho tiempo. Existe una necesidad continua en la técnica de procedimientos de ingeniería de proteínas que sean eficaces y produzcan los resultados deseados.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para variantes de ingeniería de proteínas de una proteína parental que combina mutaciones en dos o más sitios de interés; el procedimiento comprende las etapas de:

a) proporcionar una proteína parental y una biblioteca de evaluación de sitio de variantes de proteína de dicha proteína parental, donde la biblioteca de evaluación de sitio comprende variantes de la proteína parental modificado cada uno en uno de los dos o más sitios de interés;

b) comprobar dicha biblioteca de variantes de proteína y dicha proteína parental para al menos dos propiedades de interés en las respectivas pruebas de interés;

c) determinar un valor del índice de rendimiento para cada propiedad de interés dividiendo el valor obtenido para cada una de las variantes de proteína entre el valor obtenido para dicha proteína parental en la prueba de interés para proporcionar una diferencia de energía libre aparente (MMGapp) para cada una de las variantes de proteína en comparación con dicha proteína parental en la prueba de interés;

d) determinar un valor de índice de rendimiento previsto para variantes de proteína que combinan mutaciones en dos o más sitios de interés, donde el valor índice de rendimiento previsto para las variantes que combinan dos o más mutaciones se obtiene sumando los valores de MMGapp de estas mutaciones;

e) identificar a partir del valor de índice de rendimiento previsto obtenido en la etapa (d) , las variantes de proteína que combinan dos o más mutaciones y que poseen una primera propiedad mejorada con respecto a la proteína parental y una segunda propiedad que es al menos el 90% de la de la proteína parental, proporcionando de este modo una biblioteca de variantes de proteína enriquecida en miembros que tienen al menos dos de las propiedades de interés.

Esto significa que la presente invención puede usarse para identificar mutaciones que proporcionan al menos una propiedad muy mejorada y al menos una propiedad adicional que no es significativamente peor que la de la proteína natural (p. ej., mejor del 110% de la proteína natural para una propiedad, aún no peor del 90% de la natural para cualquier otra propiedad) . Aún en otras realizaciones preferidas adicionales, las bibliotecas se construyen en función de esta información. En algunas realizaciones, las bibliotecas se construyen usando todas las mutaciones identificadas, mientras que en otras realizaciones, las bibliotecas se construyen usando un subgrupo de las mutaciones identificadas. De hecho, no se pretende que las bibliotecas estén limitadas a ningún número y/o tipo en particular de mutaciones.

En algunas realizaciones, la proteína es una enzima. En algunas realizaciones especialmente preferidas, la enzima se selecciona entre proteasas, transferasas, metaloproteasas, estearasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas y lipasas. En algunas realizaciones alternativas, la proteína se selecciona a partir de anticuerpos y factores de crecimiento. Aún en realizaciones preferidas adicionales, la proteína natural es una forma madura de una enzima seleccionada entre proteasas, transferasas, metaloproteasas, estearasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas y lipasas. En algunas realizaciones preferidas, la propiedad de interés se selecciona entre carga, rendimiento de lavado, rendimiento de limpieza de superficie dura, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento, estabilidad en detergente, unión al sustrato, inhibición enzimática, nivel de expresión, velocidad de reacción y degradación del sustrato. En algunas realizaciones, la proteína natural y la variante proteica son componentes de al menos una composición detergente. En algunas realizaciones preferidas, el rendimiento del lavado se comprueba en una composición detergente formulada en un detergente en polvo o líquido que tiene un pH de entre 5 y 12, 0.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

En la figura 1 se proporcionan las distribuciones de los 2.851 valores de MMGapp obtenidos para cada propiedad.

En la Figura 2A se proporcionan los resultados obtenidos de calcular la distribución esperada de los valores de MMGapp para la estabilidad en LAS y la actividad de queratina para mil combinaciones elegidas al azar de mutaciones en los cuatro sitios, en comparación con la distribución real de los valores de MMGapp para 64 miembros de la biblioteca elegidos al azar.

En la figura 2B se muestra la distribución real observada para los 64 miembros de la biblioteca elegidos al azar.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos para la ingeniería de proteínas. Específicamente, la invención proporciona procedimientos que utilizan bibliotecas de evaluación de sitios.

Con fines prácticos, normalmente no... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para variantes de ingeniería de proteínas de una proteína parental que combina mutaciones en dos o más sitios de interés; el procedimiento comprende las etapas de:

a) proporcionar una proteína parental y una biblioteca de evaluación de sitio de variantes de proteína de dicha proteína parental, donde la biblioteca de evaluación de sitio comprende variantes de la proteína parental modificada cada una en uno de los dos o más sitios de interés;

b) comprobar dicha biblioteca de variantes de proteína y dicha proteína parental para al menos dos propiedades de interés en las respectivas pruebas de interés;

c) determinar un valor índice de rendimiento para cada propiedad de interés dividiendo el valor obtenido para cada una de las variantes de proteína entre el valor obtenido para dicha proteína parental en la prueba de interés para proporcionan una diferencia de energía libre aparente (MMGapp) para cada una de las variantes de proteína comparado con dicha proteína parental en la prueba de interés.

d) determinar un valor índice de rendimiento previsto para variantes de proteína que combinan mutaciones a dos o más sitios de interés, en el que el valor índice de rendimiento previsto para las variantes que combinan dos o más mutaciones se obtienen añadiendo los valores de MMGapp de estas mutaciones.

e) identificar a partir del valor índice de rendimiento previsto obtenido en la etapa (d) las variantes de proteína que combinan dos o más mutaciones y que poseen una primera propiedad mejorada con respecto a la proteína parental y una segunda propiedad que es al menos el 90% de la de la proteína parental, proporcionando de este modo una biblioteca de variantes de proteína enriquecida en miembros que tienen al menos dos de las propiedades de interés.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las propiedades de interés se seleccionan entre carga, rendimiento de lavado, rendimiento de limpieza de superficie dura, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento, estabilidad en detergente, unión al sustrato, inhibición enzimática, nivel de expresión, velocidad de reacción y degradación del sustrato.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que dicha proteína es una enzima.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha enzima se selecciona entre proteasas, transferasas, metaloproteasas, estearasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas y lipasas.