Procedimiento para el enriquecimiento y/o la separación de ADN procariota mediante una proteína que se une específicamente a ADN que contiene motivos CpG no metilados.

Procedimiento para la separación y/o el enriquecimiento de ADN procariota,

con los pasos de:

a) poner al menos un ADN procariota en solución en contacto con una proteína que se una específicamente al ADNprocariota y que presente una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO: 2 de modo que se forme uncomplejo proteína/ ADN, siendo la proteína capaz de reconocer motivos CpG no metilados, y

b) separar el complejo.

Procedimiento para el enriquecimiento y/o la separación de ADN procariota mediante una proteína que se une específicamente a ADN que contiene motivos CpG no metilados La invención se refiere a un procedimiento para la separación y/o el enriquecimiento de ADN procariota y/o para el desenriquecimiento de este ADN a partir de líquidos fisiológicos, usando una proteína conforme a la SEQ ID NO: 2 que se une específicamente a dinucleótidos de citidina-fosfato-guanosina (motivos CpG) no metilados de un ADN, así como al uso de un kit para la realización del procedimiento.

Las infecciones provocadas por bacterias son una de las causas más comunes de las enfermedades inflamatorias. Para el pronóstico del curso de la enfermedad, así como, en especial, para la elección oportuna de las medidas terapéuticas adecuadas, es de crucial importancia la detección temprana de los patógenos bacterianos.

Para la detección de patógenos bacterianos se siguen usando hoy en día principalmente diferentes procedimientos dependientes de cultivo. Sin embargo, estudios actuales ilustran la escasa adecuación de los procedimientos dependientes de cultivo para la detección de agentes patógenos (Hellebrand W., König-Bruhns C., Hass W., Studie zu Blutkulturdiagnostik del año 2002, póster en el Congreso Anual de la Sociedad Alemana de Higiene y Microbiología, Gotinga 2004; Straube E (2003) Sepsis -microbiological diagnosis. Infection 31:284) . De acuerdo con ellos, solo se pudieron determinar los agentes patógenos en aproximadamente 15 a 16% de todos los cultivos de sangre analizados. Los inconvenientes de estos procedimientos hicieron que precisamente en la última década, en paralelo al impetuoso desarrollo tecnológico de la biología molecular, se buscaran intensamente otras alternativas. Los primeros informes referentes al uso de procedimientos de detección de patógenos bacterianos independientes de cultivo, que se basan en el principio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , provienen de principios de los años 90. Así, por ejemplo, Miller y sus colegas (Miller N, J Clin Microbiol. 1994 Feb; 32 (2) :393-7) pudieron mostrar que los procedimientos independientes de cultivo son superiores a las técnicas clásicas de cultivo y de microscopía a la hora de detectar Mycobacterium tuberculosis. En los últimos tiempos, sin embargo, han cobrado importancia otros procedimientos de biología molecular basados en la detección de ácidos nucleicos específicos de los agentes patógenos (por ejemplo, M. Grijalva y col., Heart 89 (2003) 263-268; Uyttendaele M y col., Lett Appl Microbiol. 2003;37 (5) :386-91; Saukkoriipi A y col., Mol Diagn. 2003 Mar;7 (1) :9-15; Tzanakaki G y col., FEMS Immunol Med Microbiol. 2003 Oct 24;39 (1) :31-6) .

Como ventaja esencial frente a los procedimientos convencionales dependientes de cultivo cabe mencionar, además de la alta especificidad de tales procedimientos de biología molecular, el poco tiempo requerido. Sin embargo, la sensibilidad de la detección de ADN procariota directamente en líquidos corporales y material de análisis no tratado previamente es, hoy por hoy, demasiado baja en comparación con el cultivo de microorganismos. La obtención de una cantidad de ácidos nucleicos de bacterias suficiente para la detección directa del agente patógeno en un material de análisis no tratado previamente también es limitada en el ámbito del análisis del ARNr 16S, mediante PCR de la región 16S en el cromosoma bacteriano y el análisis siguiente de la secuencia del fragmento de PCR, puesto que normalmente se encuentran en el cromosoma varias copias del segmento codificante del ARNr 16S. La detección específica directa del agente patógeno mediante el análisis del ARNr 16S implica que en la muestra que se ha de analizar esté presente solo una especie patógena. Si existen diferentes especies patógenas en la muestra, no es posible realizar una detección específica mediante secuenciación de la región de ARNr 16S, puesto que los cebadores usados son universales para la mayoría de las bacterias. Asimismo es condición previa para la detección del agente patógeno mediante el análisis del ARNr 16S que las bacterias que se han de detectar se encuentren enla fase metabólica y expresen suficiente ARNr 16S. Ésta generalmente no se cumple, especialmente en pacientes que reciben una terapia antibiótica calculada. Además, determinados factores de patogenicidad de las bacterias no se expresan en todo momento aunque estén presentes los genes correspondientes en el genoma bacteriano. Como consecuencia, el médico clínico halla resultados falsos negativos. De este modo, es posible que una terapia antibiótica selectiva no se inicie en absoluto o se inicie demasiado tarde. En estos casos, el médico depende de su conocimiento empírico y de las directrices generales (como, por ejemplo, de la Sociedad Paul Ehrlich) y, por ello, aplicará un tratamiento antibiótico demasiado general. El uso no selectivo de los antibióticos conlleva una serie de riesgos no solo para el paciente individual (como, por ejemplo, efectos adversos innecesarios en forma de daños renales, etc.) , sino también para toda la sociedad (por ejemplo, el desarrollo de resistencias adicionales a antibióticos tales como MRSA (Staphylococcus aureus resistente a meticilina, etc.) ) . Por ese motivo, la detección de los factores de patogenicidad y las resistencias clínicamente relevantes de las bacterias a nivel cromosómico y plasmídico, es decir, finalmente a nivel de ADN, ofrece ventajas considerables para el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas, pero también de la sepsis. Esto es tanto más importante en cuanto a que a este nivel también se puede distinguir entre bacterias patógenas y comensales.

En la mayoría de los casos la detección de ácidos nucleicos específicos del agente patógeno se lleva a cabo mediante técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) , como, por ejemplo, la multiplicación del ADN procariota mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la reacción en cadena de la ligasa (LCR) . La alta especificidad y la rápida disponibilidad de los resultados se oponen a la propensión a fallos por contaminaciones o factores fuertemente inhibidores de la reacción presentes en las muestras clínicas.

En un procedimiento de detección por PCR convencional debe estar presente teóricamente al menos 1 ADN diana del agente patógeno en 10 µl de sangre para una detección eficaz de agentes patógenos en sangre. Esto equivale a aproximadamente 100 dianas en 1 ml de sangre, o 1.000 dianas en 10 ml de sangre. El caso es distinto cuando se cultiva sangre para la detección de agentes patógenos en una infección. En este caso, el límite de detección inferior se encuentra en aproximadamente 3 a 5 bacterias por 10 ml de sangre.

Este límite de detección actualmente todavía no se alcanza con los procedimientos de PCR, tampoco con aquellos cuya secuencia diana se encuentra en la zona de la región del ARNr 16S en el cromosoma. Aunque en el cromosoma bacteriano se localizan varias regiones que codifican el ARNr 16S (normalmente 3 a 6) , sigue sin cumplirse la condición previa de que se encuentre al menos una molécula del ADN molde en la mezcla de reacción de la PCR.

Cabe esperar una mayor seguridad diagnóstica con procedimientos de PCR cuyas secuencias diana específicas codifiquen proteínas específicas de especie, bien en el cromosoma o bien en los plásmidos de los microorganismos. También en este caso se aplica lo dicho anteriormente respecto al límite de detección. Precisamente bajo la influencia de una terapia antibiótica en curso, el crecimiento de los agentes patógenos puede estar fuertemente ralentizado, limitado o bloqueado, aun cuando el antibiótico usado no presente finalmente una eficacia óptima. Esta situación se presenta con frecuencia precisamente en aquellos pacientes que ya se encuentran bajo tratamiento antibiótico y en los que, por esta razón, no se pueden cultivar bacterias patógenas a partir de los cultivos de sangre u otras muestras (como, por ejemplo, frotis traqueales, lavados broncoalveolares (LBA) , etc.) .

Debido a la insuficiente sensibilidad, la detección de ácidos nucleicos específicos de agentes patógenos sin paso de amplificación mediante la detección directa del ADN procariota (técnica de sondeo, técnica FISH) solo tiene importancia diagnóstica si el número de gérmenes en el material de análisis es suficientemente elevado.

La problemática esencial de la detección de ADN procariota para la identificación de patógenos bacterianos en líquidos corporales reside sobre todo, además de en los componentes inhibidores de la PCR... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la separación y/o el enriquecimiento de ADN procariota, con los pasos de:

a) poner al menos un ADN procariota en solución en contacto con una proteína que se una específicamente al ADN procariota y que presente una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO: 2 de modo que se forme un complejo proteína/ ADN, siendo la proteína capaz de reconocer motivos CpG no metilados, y b) separar el complejo.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que le sigue a la separación un paso para separar el ADN de la proteína a partir del complejo.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína está unida a un soporte.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la proteína está unida directamente al soporte.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la proteína está unida al soporte a través de un anticuerpo dirigido contra la proteína.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la proteína está unida al soporte a través de un espaciador.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que se usa un resto diaminohexano como espaciador.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el soporte está configurado en forma de matriz, micropartículas o membrana.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que se usa Sepharose como matriz.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la separación se lleva a cabo mediante un anticuerpo o antisuero dirigido contra la proteína.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la separación se lleva a cabo mediante electroforesis.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución contiene una mezcla de ADN eucariota y procariota.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que en el caso del ADN procariota se trata de ADN bacteriano.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el que la solución es un líquido corporal o deriva de él, en particular sangre entera, suero, plasma, preparaciones celulares de sangre entera, orina, fluidos, líquido pleural, pericárdico, peritoneal, sinovial y lavado broncoalveolar.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la separación se logra mediante un filtro que recoge por filtración los complejos ADN/ proteína correspondientes y en el que la proteína se encuentra inmovilizada en una matriz filtrante.

16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15 para la aplicación en la técnica medioambiental, la gestión del agua y de aguas residuales y la técnica climática.

17. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que, adicionalmente, después del paso b) se amplifica el ADN procariota en el paso c) .

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, con los pasos:

a) aislamiento del ADN procariota a partir del complejo proteína/ ADN, b) desnaturalización del ADN de cadena doble, c) hibridación de las cadenas sencillas del ADN con cebadores complementarios, d) generación de fragmentos de cadena doble mediante una reacción con polimerasas y e) repetición de estos pasos hasta obtener el grado de amplificación deseado.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, con lo pasos:

a) clonación de las secuencias de ADN procariotas aisladas en vectores, b) transformación de células huésped adecuadas con estos vectores, c) cultivo de estas células transformadas, d) aislamiento de los vectores a partir de estas células y e) aislamiento del ADN.

20. Uso de un kit que contiene al menos una proteína de unión específica a ADN procariota que presenta una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO: 2 para la separación y/o el enriquecimiento de ADN procariota mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 19.

21. Procedimiento para la separación y/o el enriquecimiento de ADN genómico no metilado a partir de una mezcla de ADN genómico no metilado y ADN genómico metilado, con los pasos de: a) poner un ADN genómico no metilado en solución en contacto con una proteína que se una específicamente a ADN no metilado y que presente una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO: 2 de modo que se forme un complejo proteína/ ADN y b) separar el complejo.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21 para el diagnóstico de enfermedades que presentan un patrón de metilación específico del ADN genómico, en especial de cánceres.