Método de cuantificación del número de células de bacterias del ácido láctico viables (LAB) en una muestra queincluye las fases de:

1: preparar una composición comprendiendo:

a) las células de LAB;

b) un tinte que se asocia con las células de LAB individuales y que es indicativo del potencial de membranacelular de dichas células individuales;

c) un medio de crecimiento complejo en una concentración que es 2% a 20% (calculado del conjunto decomposición) de la concentración recomendada cuando se usa como un medio de crecimiento para LABs.;

2: incubar bajo condiciones donde las células viables retienen dicho potencial de membrana celular mientras sucrecimiento es inhibido;

3: detectar una propiedad óptica de la composición de tinte asociada a dichas células individuales; y

4: cuantificar el número de células viables en la muestra.

Cuantificación de la viabilidad de bacterias del ácido láctico usando citometría de flujo

Campo de la invención

La presente invención pertenece a un método de cuantificación del número de células de bacterias del ácido láctico viables (LAB) en una muestra.

Antecedentes de la invención

Bacterias que fermentan azúcares con la producción de ácidos en particular ácido láctico como un componente metabólico mayor han sido conocidas por mucho tiempo. Tales bacterias se pueden encontrar en la leche o productos lácteos, plantas vivas o en descomposición pero también en el intestino del hombre y animales. Generalmente, estas bacterias han sido referidas como "bacterias del ácido láctico". Bacterias del ácido láctico (LAB) designan un grupo más bien heterólogo de bacterias anaeróbicas o microaerofílicas gram positivas no móviles, que fermentan azúcar con la producción de ácidos incluyendo ácido láctico y comprenden por ejemplo, los géneros Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Durante siglos, cultivos iniciadores de siglos de bacterias del ácido láctico han sido usados en la producción de productos alimentarios y de alimentos para animales incluyendo la mayoría de productos lácteos y hoy en día las bacterias del ácido láctico son esenciales en la producción de todos los productos lácteos fermentados tales como yogur, queso y mantequilla. Además las bacterias del ácido láctico son muy usadas en la industria de procesamiento de la carne, en la industria de fabricación de vino, en la industria de fabricación de zumo al igual que varias otras industrias. La publicación de una gran cantidad de informes documentando que varias bacterias lácticas afectan beneficiosamente al bienestar de los seres humanos y/o animales han atraído incluso más interés para este grupo de bacterias. En particular, se ha encontrado que cepas específicas de Lactobacillus o Bifidobacterium son capaces de colonizar la mucosa intestinal y de asistir en el mantenimiento del bienestar de los huéspedes. Microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud en el huésped, se denominan como organismos probióticos, o probióticos (FAO / WHO 2002) .

El uso como cultivo iniciador y como probióticos implican que las LAB sean expuestas a varias condiciones de tensión que pueden afectar a su viabilidad. Ambos cultivos iniciadores y probióticos son por cuestiones prácticas frecuentemente proporcionados en una forma liofilizada. Es bien conocido en la técnica que el número de células viables de bacterias del ácido láctico es significativamente reducido durante el proceso de liofilización. Como las actividades metabólicas que caracterizan las células vivas son esenciales para el uso como cultivos iniciadores y como probióticos, el contenido de las células vivas debería ser establecido para cada lote de un cultivo iniciador o una composición probiótica. Además, también es bien conocido que el número de células vivas se reduce durante el almacenamiento. Así, para asegurar que los productos proporcionan células vivas suficientes el tiempo de conservación de los productos debería ser controlado controlando la cantidad de células vivas en las pruebas rápidas a intervalos regulares.

De forma convencional, el contenido de células viables ha sido realizado por la determinación de unidades formadoras de colonias (CFU) por la técnica de conteo sobre placa, en la que se sigue la formación de colonias visibles en un medio de crecimiento de agar apropiado.

Células vivas se caracterizan por un gradiente potencial eléctrico con el citosol siendo eléctrico negativo con respecto al entorno exterior. El mantenimiento del potencial de membrana requiere un metabolismo de energía activa en células eucariotas al igual que en células bacterianas. Como el gasto de energía metabólica se requiere para mantener potenciales, el potencial a través de la membrana de una célula deteriorada o moribunda se disminuye en magnitud. En bacterias el potencial de membrana se disminuye o se pierde minutos después de la eliminación de fuentes de energía. El potencial de la membrana también disminuye o se pierde si la membrana celular bacteriana se rompe o se daña de otra manera por medios químicos o físicos (Shapiro; (1990) ASM news 56, 584-588) . Así, el nivel del potencial de membrana es un indicador altamente sensible no sólo de la integridad de membrana sino del estado general fisiológico de la célula bacteriana individual.

Novo et al. (1999) describen un ensayo para determinar el potencial de membrana para células bacterianas individuales. Basan su ensayo en el tinte fluorescente de yoduro de 3, 3'-dietiloxacarbocianina (DiOC2 (3) ; DiOC) . DiOC es lipofílico, pero también positivamente cargado. El tinte tiñe las bacterias con fluorescencia verde, que refleja supuestamente la distribución de tinte por los lípidos en la membrana y constelaciones hidrofóbicas de la célula. La generación de energía celular conduce a un gradiente electroquímico a través de la membrana. El potencial eléctrico (interno negativo) cambia la distribución de DiOC por medio de una electrofóresis hacia adentro. Como se discute por Novo et al. (1999) la acumulación de tinte probablemente conduce a la formación de agregados de tinte en las partes acuosas del citosol que resultan en un cambio a rojo en la emisión de fluorescencia del tinte que es indicativo de células con un potencial de membrana "normal".

La citometría de flujo (FCM) es una técnica rápida para análisis de células individuales. En FCM, se analizan células individuales a índices de 100 a 1000 por s ya que se soportan dentro de un fluido de flujo rápido que pasa una fuente de luz láser típicamente el dispersador de luz en ángulo frontal (FSC) , dispersador de luz en ángulo lateral (SSC) , y la fluorescencia de células individuales a longitudes de onda seleccionadas son medidas.

Varias sondas diferentes fluorescentes han sido desarrolladas para la evaluación de la viabilidad usando técnicas de FCM. La bibliografía proporciona ejemplos del uso de sondas fluorescentes para controlar varios parámetros fisiológicos tales como el contenido de ADN, actividad enzimática, respiración, potencial de membrana, pH intracelular, e integridad de la membrana a nivel de la célula individual (Bunthof, 2001 y Ben Amor, 2002) . Particularmente, se ha utilizado ampliamente en ensayos de viabilidad que se basan en la detección de la integridad de membrana. Recientemente, no obstante, fue proporcionado que las determinaciones de CFU no parecen estar relacionadas con los resultados obtenidos con el test de viabilidad basado en la integridad de la membrana celular durante el almacenamiento de Bifidobacteria (Lathinen, 2005) . Como se proporciona en el ejemplo 1 hemos observado resultados similares con células de Lactobacillus durante el almacenamiento.

Para concluir, la determinación de CFU es el método de referencia estándar para la prueba de viabilidad usada para la industria láctea. Desafortunadamente, la determinación de unidades formadoras de colonias es un ensayo más bien lento y de trabajo muy intensivo que ha demostrado ser muy difícil de automatizar. Así, hay una necesidad persistente de métodos que permiten una cuantificación rápida y fiable de células viables y que se puede correlacionar con el número de CFU.

Resumen de la invención

El problema subyacente a la presente invención fue proporcionar un método rápido y fiable de cuantificación de la cantidad de LAB vivas en una muestra. Fue deseado que el método de cuantificación del número de células bacterianas del ácido láctico (LAB) viables en una muestra fuera suficientemente "resiliente" a variaciones en los tiempos de ensayo que es una característica de cribado de alto rendimiento.

Para obtener un protocolo de evaluación de la viabilidad de alto rendimiento eficaz hemos inventado un método basado en FCM de cuantificación de la viabilidad de LAB que fácilmente se puede enlazar a un robot de manipulación de líquidos y por tanto automatizado. No obstante, para obtener un rendimiento satisfactorio las distintas fases en el procedimiento deben ser realizados secuencialmente, el resultado siendo que el tiempo de proceso de una muestra individual se aproxima a una hora, durante el cual el número de células viables en una muestra desafortunadamente no es constante.

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que el potencial... [Seguir leyendo]

1. Método de cuantificación del número de células de bacterias del ácido láctico viables (LAB) en una muestra que incluye las fases de:

1: preparar una composición comprendiendo: a) las células de LAB; b) un tinte que se asocia con las células de LAB individuales y que es indicativo del potencial de membrana celular de dichas células individuales; c) un medio de crecimiento complejo en una concentración que es 2% a 20% (calculado del conjunto de composición) de la concentración recomendada cuando se usa como un medio de crecimiento para LABs.;

2: incubar bajo condiciones donde las células viables retienen dicho potencial de membrana celular mientras su crecimiento es inhibido;

3: detectar una propiedad óptica de la composición de tinte asociada a dichas células individuales; y

4: cuantificar el número de células viables en la muestra.

2. Método según la reivindicación 1, donde el medio de crecimiento complejo es MRS.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la incubación en la fase (2) se realiza a una temperatura, que es al menos 10°C inferior a la temperatura de crecimiento óptima de las células de bacterias del ácido láctico.

4. Método según la reivindicación 3, donde las bacterias del ácido láctico son organismos mesofílicos con temperaturas de crecimiento óptimas a aproximadamente 30°C.

5. Método según la reivindicación 3, donde las bacterias del ácido láctico son organismos termofílicos con temperaturas de crecimiento óptimas en el intervalo de 40 a 45°C.

6. Método según la reivindicación 4, donde la incubación en la fase (2) se realiza a una temperatura en el intervalo entre 10°C a 25°C.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la detección en la fase (3) se realiza por citometría de flujo, por ejemplo midiendo la fluorescencia.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición de tinte comprende glucosa a una concentración que es 0, 5-10%, preferiblemente 1 -10% y lo más preferido 2-5% vol/vol (concentración final) .

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el tinte es DiOC.