NORMALMENTE LOS GENES TRANSCRIPCIONALMENTE INACTIVOS EN UNA LINEA CELULAR EUCARIOTICA PUEDEN SER ACTIVADOS PARA EXPRESION MEDIANTE LA INSERCION DE UN ELEMENTO REGULADOR DE ADN QUE ES CAPAZ DE PROMOVER LA EXPRESION DE UN PRODUCTO GENETICO NORMALMENTE EXPRESADO EN ESA CELULA,

EL ELEMENTO REGULADOR SIENDO INSERTADO PARA ESTAR OPERATIVAMENTE UNIDO AL GEN NORMALMENTE INACTIVO EN CUESTION. LA INSERCION SE REALIZA POR MEDIO DE RECOMBINACION HOMOLOGA, UTILIZANDO UNA CONSTRUCCION DE ADN QUE INCLUYA UN SEGMENTO DE ADN DEL GEN NORMALMENTE INACTIVO ("ADN DIANA") Y EL ELEMENTO REGULADOR DE ADN PARA INDUCIR LA TRANSCRIPCION. LA TECNICA TAMBIEN SE UTILIZA PARA MODIFICAR LAS CARACTERISTICAS DE EXPRESION DE CUALQUIER GEN ENDOGENO DE UNA LINEA CELULAR EUCARIOTICA DADA.

Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la modificación de las características de expresión de un gen que está presente naturalmente en el genoma de una estirpe celular estable o microorganismo clonado. En la realización preferida, la presente invención se refiere a un proceso para la activación y expresión de un gen que está presente en una estirpe celular estable y normalmente transcripcionalmente silencioso o inerte. Como resultado, se expresa el producto proteína de ese gen. Este fenómeno ocurre sin transfectar la célula con el ADN que codifica el producto. En su lugar, el gen residente codificante del producto deseado se identifica en una célula y se activa insertando un segmento regulador apropiado mediante una técnica denominada recombinación homóloga. Pueden insertarse también marcadores seleccionables positivos y/o negativos para ayudar a la selección de las células en las que han ocurrido los eventos de recombinación homóloga apropiados. Como realización adicional, un gen especificado puede amplificarse para tasas de expresión potenciadas, tanto si ese gen es normalmente transcripcionalmente silencioso y se ha activado mediante la presente invención, como si expresa producto endógenamente.

Antecedentes de la invención

Es bien conocido que cada célula en un organismo contiene la información genética que codifica todas las proteínas encontradas en ese organismo. Sin embargo, sólo un porcentaje muy pequeño de los genes presentes en un tipo celular dado se transcribe realmente. Los mecanismos intracelulares que regulan el conjunto de genes a transcribir son ahora entendidos. Las proteínas específicas de célula presentes en el núcleo interaccionan con segmentos reguladores de ADN que están ligados a genes particulares. Esta interacción de proteínas nucleares con secuencias reguladoras de ADN es necesaria para la transcripción génica. Esto da como resultado la biosíntesis de ARNm y la expresión última de la proteína codificada (Mitchell y Tjian, Science, 245: 371, 1989).

Estos segmentos o elementos reguladores de ADN para cada gen se encuentran cadena arriba y, en algunos casos, en o incluso cadena abajo de las regiones codificantes. Mediante una interacción con proteínas nucleares específicas de célula, los segmentos reguladores de ADN afectan a la capacidad de la ARN polimerasa, la enzima limitante de la velocidad en la expresión de proteínas, de tener acceso al cuerpo del gen y sintetizar un transcripto de ARNm. Por tanto, estos segmentos de ADN y las proteínas nucleares residentes desempeñan un papel crítico en la regulación de la expresión de genes específicos (Johnson y McKnight, Ann. Rev. Biochem., 58: 799, 1989).

Los segmentos reguladores de ADN son sitios de unión para las proteínas nucleares. Estas proteínas nucleares se unen a la hélice de ADN y aparentemente alteran su estructura para poner a disposición el gen deseado para reconocimiento por la ARN polimerasa, lo que facilita la transcripción génica. La expresión de estas proteínas reguladoras específicas de célula determina cuáles genes se transcribirán en una célula y la tasa a la que ocurrirá esta expresión. Como ejemplo de la especificidad de este sistema, las células pituitarias, pero no las células hepáticas, expresan proteínas pituitarias, aunque los genes para las proteínas pituitarias están presentes en todas las células hepáticas. Los núcleos de las células hepáticas no contienen las proteínas de unión a ADN específicas que interaccionan con los elementos de los genes de pituitaria residentes en las células hepáticas.

Métodos actuales empleados para expresar proteínas utilizando tecnología de ADN recombinante

Con el conocimiento de que se requieren secuencias reguladoras de ADN específicas para activar la transcripción génica en un tipo celular particular, los científicos han expresado genes extraños en un tipo celular particular mediante ingeniería genética. En general, los segmentos reguladores de ADN que son reconocidos por las proteínas nucleares de la célula se disponen cadena arriba de la región codificante de un gen extraño a expresar. De este modo, después de la inserción en la célula, el ADN extraño puede expresarse, puesto que las proteínas reguladoras nucleares de la célula reconocen ahora estas secuencias reguladoras de ADN. Esta tecnología se ha empleado para producir proteínas que han sido difíciles de obtener o purificar a partir de fuentes naturales mediante estrategias de purificación tradicionales.

Además de las secuencias de ADN reconocibles y del gen de interés, se une un marcador seleccionable a la construcción de ADN. De este modo, sólo las células que han incorporado el ADN sobreviven al cultivo siguiente en un medio seleccionable. Por ejemplo, el gen para resistencia a la neomicina puede incluirse en el vector de expresión. Después de la transfección, las células se cultivan en G418, un antibiótico de neomicina que es letal para las células de mamífero. Sin embargo, si las células han adquirido el gen de resistencia a la neomicina, serán capaces de soportar los efectos tóxicos del fármaco. De este modo, sólo las células que han incorporado el ADN transfectado se mantienen en el cultivo. Se entiende que podría utilizarse cualquier marcador seleccionable siempre que proporcione la selección de células que hayan incorporado el ADN transfectado. Se entiende además que no es crítica la localización específica del material genético insertado en la célula. Sólo es importante que se incorpore a algún sitio en el núcleo de modo que tanto el segmento regulador como el gen extraño (así como el marcador seleccionable) se insertan conjuntamente.

Deficiencias en los métodos actuales de expresión génica

Aunque las técnicas anteriores han sido los instrumentos de explotación de la potencia de la ingeniería genética, no han sido siempre los métodos más eficaces para expresar genes. Esto es debido al hecho de que la inserción de ADN en el núcleo de una estirpe celular se realiza habitualmente mediante una técnica conocida como transfección. El ADN que se ha modificado por ingeniería genética para expresión en la estirpe celular de interés se precipita, y la membrana celular se solubiliza para permitir la entrada del ADN. Como se indica anteriormente, el sitio exacto en el que el ADN se incorpora al genoma no es nunca predecible; es más, el ADN puede permanecer episomal (no integrado en el genoma). Esto da como resultado la impredecibilidad tanto del nivel de expresión de la proteína producida como de la estabilidad de la estirpe celular.

Un segundo inconveniente de esta técnica es el hecho de que la construcción del vector de expresión es extremadamente difícil cuando el gen de interés es relativamente grande (mayor de 5-10 kilobases). Muchas de las proteínas expresadas por tecnología de ADN recombinante se han codificado por ADNc en lugar de clones genómicos mucho mayores. Esto se hace para reducir el tamaño total del inserto. Aunque el uso de ADNc hace la ingeniería genética más conveniente, como resultado las tasas de transcripción génica y producción de proteína pueden sufrir. Se ha mostrado recientemente que los niveles de expresión se potencian a veces en gran medida mediante el uso de insertos de ADN genómico en lugar de ADNc (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 836-840, 1988, y Chung y Perry, Mol. Cell. Biol., 9: 2075-2082, 1989). Aunque los mecanismos responsables de esta observación no se comprenden bien, es sabido que en ciertas situaciones los elementos potenciadores presentes en intrones pueden mejorar la eficacia transcripcional del gen. Existen también evidencias de que los intrones, o los eventos de ayuste como resultado de la presencia de intrones, pueden tener un efecto sobre los eventos de procesamiento de ARN que siguen a la iniciación de la transcripción (Buchman y Berg., Mol. Cell. Biol., 8: 4395-4405, 1988). Esto puede estabilizar el transcripto, mejorando así la tasa de acumulación de ARNm. En el artículo de Brinster et al. anteriormente citado, se postula también que la posición de los intrones en el gen puede ser importante para poner en fase los nucleosomas respecto al promotor. Se discute la influencia de diversos elementos reguladores sobre la transcripción de genes eucarióticos en Khoury et al., Cell, 33: 313-314 (1983), Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245... [Seguir leyendo]

1. Un constructo de ADN adecuado para uso en la modificación de las características de expresión de un gen preseleccionado en una estirpe celular hospedadora eucariótica predeterminada y adecuado para dirigir dicho gen preseleccionado mediante recombinación homóloga, comprendiendo el constructo:

2. Un constructo de ADN según la reivindicación 1, en el que el segmento regulador de ADN (F) es un promotor.

3. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos el segmento B de direccionamiento de ADN es homólogo de una región no codificante del genoma.

4. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el segmento A de direccionamiento de ADN incluye una porción del gen preseleccionado.

5. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marcador seleccionable positivo tiene una región promotora transcripcionalmente activa diferente del segmento regulador de ADN (F).

6. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el marcador seleccionable negativo tiene una región promotora transcripcionalmente activa diferente del segmento regulador de ADN (F).

7. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen amplificable tiene una región promotora transcripcionalmente activa diferente del segmento regulador de ADN (F).

8. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 a 7, en el que el marcador seleccionable positivo se selecciona de adenosina desaminasa (ADA), aminoglicósido fosfotransferasa (neo), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina quinasa (tk), xantina-guanina fosforribosiltransferasa (gpt), gen de resistencia múltiple a fármacos (MDR), ornitina descarboxilasa (ODC) y resistencia al N-(fosfonoacetil)-L-aspartato (CAD).

9. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 a 8, en el que el marcador seleccionable negativo es el gen de timidina quinasa del herpesvirus simplex (HSVtk).

10. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 a 9, en el que el gen amplificable se selecciona de DHFR, MDR, ODC, ADA y CAD.

11. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el constructo de ADN está linealizado.

12. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el constructo de ADN es circular.

13. Uso de un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para modificar las características de expresión de un gen preseleccionado en una estirpe celular hospedadora eucariótica predeterminada.

14. Uso de un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la expresión de proteínas en una estirpe celular hospedadora predeterminada.

15. Uso según la reivindicación 13 ó 14, en el que la célula hospedadora eucariótica es una estirpe celular estable.

16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la célula hospedadora eucariótica es una estirpe celular diferenciada.

17. Una célula hospedadora eucariótica transfectada con un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. Un genoma que comprende un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

19. Uso de una célula según la reivindicación 17 para la producción de un producto génico.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que el producto génico es el ARNm de dicho gen.

21. Uso según la reivindicación 19, en el que el producto génico es el producto proteína.

22. Proceso para la preparación de un producto génico que comprende la etapa de cultivar la célula según la reivindicación 17.

23. Proceso según la reivindicación 22, que comprende además la etapa de selección química.

24. Proceso según la reivindicación 22 ó 23, que comprende además la etapa de monitorizar la producción del producto génico específico del gen recién activado en la estirpe celular hospedadora eucariótica.