COMPOSICIONES PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPASA Y MÉTODO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD.

Composiciones para la determinación de la actividad lipasa y método para determinar la actividad. Campo técnico La presente invención se refiere a una composición para determinar la actividad de la lipasa pancreática o de lipasas no pancreáticas (tales como lipasa hepática o lipasa de lipoproteínas), y a un método para determinar la actividad en el campo de los ensayos clínicos de laboratorio. Antecedentes de la técnica La lipasa pancreática en sangre es importante como marcador de diagnóstico de enfermedades pancreáticas, tales como la pancretatitis aguda, y se ha empleado en ensayos clínicos habituales. Por otra parte, la lipasa hepática o la lipasa de lipoproteínas (denominadas colectivamente en lo sucesivo en la presente lipasas no pancreáticas) son enzimas importantes en el diagnóstico de enfermedades hepáticas o del metabolismo de lípidos de las lipoproteínas. Las lipasas no pancreáticas desempeñan un papel en el cuerpo vivo en forma de un conjugado con glicoproteínas ácidas del hígado o de diversos órganos/paredes vasculares. Las lipasas no pancreáticas aparecen en sangre por la inyección intravenosa de heparina o por el uso de la heparina durante una diálisis o similares, pero la actividad es extremadamente baja. De manera convencional, para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática y/o para la determinación de la actividad de lipasas no pancreáticas en sangre, se ha empleado un triglicérido como sustrato. El triglicérido se ha empleado en una forma denominada emulsión, preparada emulsionando/dispersando el triglicérido mediante agitación vigorosa en un tampón con goma arábiga, poli(alcohol vinílico), etc. La determinación de la actividad lipasa empleando el sustrato se ha realizado cuantificando un ácido graso liberado por una reacción de lipasa mediante un alcalímetro. Se ha realizado un intento por determinar los niveles de ácidos grasos liberados a partir del sustrato de lipasa en una reacción de lipasa mediante un método enzimático, pero ha resultado imposible determinar la actividad lipasa de modo espectrofotométrico utilizando un sistema de enzimas acoplantes, debido a la intensa turbidez del sustrato de triglicéridos debido a la emulsión. Por otra parte, un sustrato en emulsión tiene la desventaja de poder provocar la separación de fases durante la conservación, y ha resultado difícil determinar la actividad lipasa con una buena reproducibilidad. Además, para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas se emplea en la práctica un triglicérido marcado con un compuesto radiactivo como sustrato, porque la actividad de las lipasas no pancreáticas es más baja en sangre que la de la lipasa pancreática, y se separan un ácido graso libre liberado por una reacción de lipasa y un sustrato de triglicéridos, seguido de la determinación de la radiactividad del ácido graso libre (documento que no es una patente (1)). Sin embargo, existen muchas restricciones a la hora de manipular un compuesto radiactivo, y el método no resulta adecuado para los ensayos clínicos habituales. Para resolver estos problemas del método que emplea un sustrato de triglicéridos se han desarrollado métodos que emplean un diglicérido como sustrato (documentos de patente 1 y 2). En los documentos de patente, se emplea principalmente un 1,2-diglicérido como sustrato de las lipasas. Se sabe que el 1,2-diglicérido se transforma en un 1,3-diglicérido mediante una reacción de migración intramolecular de un enlace éster, y se ha utilizado para no provocar el cambio en la mayor medida posible. El documento JP-A-03228699 describe una composición de reactivos para determinar la actividad lipasa mientras que se evita la influencia de la bilirrubina, teniendo dicha composición un pH de 8-9, y comprende (a) 0,3-1,0 mM de un 1,2-diglicérido del ácido laúrico; (b) 0,05-0,2% en peso de un tensioactivo no iónico; (c) 0,4-2,5 U/ml de una monoglicérido lipasa; (d) 0,05-3 U/ml de una glicerol quinasa; (e) 15-150 U/ml de una ácido glicerofosfórico oxidasa; (f) 0,02-0,1% en peso de un compuesto fenólico o un derivado de anilina; (g) 0,01-0,1% en peso de 4aminoantipirina; (h) 0,25-3 U/ml de una peroxidasa; y (i) 1-15 nmol/ml de un complejo de hierro. Fossati et al., Clinical Chemistry, 38(2), 211-215 (1992) han descrito un ensayo colorimétrico cinético de la lipasa en suero que utiliza el kit de reactivos disponible en el mercado Sera-Pak® rk (Bayer Diagnostici SpA.), comprendiendo dicho kit una disolución 1 que contiene cantidades concretas de un tampón, 1,2-diglicérido, colipasa, 2- monoglicérido lipasa, glicerol quinasa, glicerol-3-fosfato oxidasa, peroxidasa, ascorbato oxidasa, ATP, iones de calcio, iones de magnesio, TOOS, ferrocianuro de potasio, ácido cólico, y tensioactivo de polioxietilén nonilfenil éter. Las disoluciones conocidas de diglicéridos en un tensioactivo no iónico son inestables y no pueden conservarse durante largos periodos de tiempo. Por tanto, en la práctica, en un reactivo o en un kit que emplee un diglicérido como sustrato, el sustrato debe liofilizarse, y por tanto se requiere una operación de disolución antes del uso con lo que se complica su uso. Por otra parte, tal como se describió anteriormente, resulta difícil determinar la actividad enzimática de las lipasas no pancreáticas en una muestra de sangre, así que en años recientes, en el campo de los ensayos clínicos de laboratorio se ha estado realizando un método para determinar el nivel de proteínas de la lipasa empleando un anticuerpo monoclonal mediante una técnica inmunológica (documento que no es una patente 2). Sin embargo, la 2   técnica inmunológica se emplea para cuantificar el nivel de proteínas de las lipasas y tiene la desventaja de que no determina la actividad enzimática que muestra la función lipasa. Bajo estas circunstancias, se desea desarrollar una técnica precisa, sensible y fácil para determinar la actividad de la lipasa pancreática o de las lipasas no pancreáticas. [Documento de patente 1] JP 59-91898 A [Documento de patente 2] JP 63-245672 A [Documento que no es una patente 1] J. Clin. Invest., 1986, vol. 78, ejemplar 6, 1523-1528. [Documento que no es una patente 2] Japanese Journal of Occupational Medicine and Traumatology, vol. 52/Clinical Chemistry, vol. 33, nº 3, 2004, p. 220. Descripción de la invención Problemas resueltos por la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición para la determinación de la actividad lipasa que está en forma líquida y tiene una excelente estabilidad de conservación a largo plazo. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un reactivo fácil de usar para la determinación de la actividad lipasa, un kit para la determinación de la actividad lipasa, y un método para determinar la actividad lipasa. De modo específico, un objeto es proporcionar una composición excelente comparada con una composición convencional para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática en el campo de los ensayos clínicos de laboratorio, y un método para determinar la actividad de la lipasa pancreática utilizando la composición. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas, con alta sensibilidad y especificidad por las lipasas no pancreáticas, en una muestra, en particular una muestra de sangre, y un método para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas que emplea la composición con facilidad y alta precisión. Medios para resolver los problemas Para determinar la actividad de la lipasa pancreática de manera estable, en primer lugar el inventor de la presente invención concentró su atención sobre la estabilidad del 1,2-diglicérido que se emplea en este caso como sustrato, y después, descubrió que la actividad lipasa cambia debido a una hidrólisis gradual del 1,2-diglicérido en un reactivo durante un largo periodo de conservación, y descubrió que el cambio dificulta la determinación de la actividad de la lipasa pancreática de una manera estable y precisa. Para resolver estos problemas, el inventor realizó estudios profundos para descubrir un diglicérido con excelente estabilidad y, como resultado, descubrió que puede prepararse un reactivo para determinar la actividad lipasa de forma estable empleando diglicéridos que incluyan una gran cantidad de 1,3-diglicérido convertido tratando el 1-2,diglicérido en un tampón alcalino de baja concentración. Por otra parte, el inventor de la presente invención descubrió que el diglicérido es útil como sustrato de lipasas no pancreáticas, y ha establecido un nuevo método para determinar la actividad de las lipasas no pancreáticas que incluye: preparar un sustrato de lipasa para su uso para la determinación de una reacción de lipasas no pancreáticas... [Seguir leyendo]

1.- Una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa, que se caracteriza porque comprende un diglicérido, un tampón de baja concentración en el intervalo de 0,5 a 9 mM, y un tensioactivo no iónico. 2-. Una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa según la reivindicación 1, en la que los diglicéridos son una mezcla de 1,3-diglicéridos y 1,2-diglicéridos. 3.- Una composición para la determinación de la actividad lipasa, que se caracteriza porque comprende la disolución de diglicéridos según la reivindicación 1 ó 2, y una enzima o enzimas que convierten un monoglicérido liberado de los diglicéridos según la reivindicación 1 ó 2, mediante una reacción de lipasa, en glicerol-3-fosfato a través del glicerol libre. 4.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas que incluye: (1) el reactivo 1 que contiene al menos un tampón de alta concentración en el intervalo de 50 a 500 mM, monoglicérido lipasa, ATP, glicerol quinasa, glicerol-3-fosfato oxidasa, y peroxidasa; y (2) el reactivo 2 que contiene al menos una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa según la reivindicación 1 ó 2. 5.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas que incluye: (1) el reactivo 1 que contiene al menos un tampón de alta concentración en el intervalo de 50 a 500 mM, monoglicérido lipasa, ATP, glicerol quinasa, NAD oxidado o NADP oxidado, glucosa, hexoquinasa dependiente de ADP, y glucosa- 6-fosfato deshidrogenasa; y (2) el reactivo 2 que contiene al menos una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa según la reivindicación 1 ó 2. 6.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas que incluye: (1) el reactivo 1 que contiene al menos un tampón de alta concentración en el intervalo de 50 a 500 mM, monoglicérido lipasa, ATP, glicerol quinasa, NAD reducido, fosfoenolpiruvato, piruvato quinasa, y lactato deshidrogenasa; y (2) el reactivo 2 que contiene al menos una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa según la reivindicación 1 ó 2. 7.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la proporción molar de tensioactivo no iónico a diglicérido es de 2,5 veces molar o mayor. 8.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que el reactivo 1 y/o el reactivo 2 está en forma líquida. 9.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática que incluye: (1) el reactivo 1 que contiene al menos una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa según la reivindicación 1 ó 2, monoglicérido lipasa, ATP, glicerol quinasa, glicerol-3-fosfato oxidasa, y peroxidasa; y (2) el reactivo 2 que contiene al menos un tampón de alta concentración en el intervalo de 50 a 500 mM, y un ácido biliar o su sal. 10.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática que incluye: (1) el reactivo 1 que contiene al menos una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa según la reivindicación 1 ó 2, monoglicérido lipasa, ATP, glicerol quinasa, NAD oxidado o NADP oxidado, glucosa, hexoquinasa dependiente de ATP, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; y (2) el reactivo 2 que contiene al menos un tampón de alta concentración en el intervalo de 50 a 500 mM, y un ácido biliar o su sal. 11.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática que incluye: (1) el reactivo 1 que contiene al menos una disolución de diglicéridos para la determinación de la actividad lipasa según la reivindicación 1 ó 2, monoglicérido lipasa, ATP, glicerol quinasa, NAD reducido, fosfoenolpiruvato, piruvato quinasa, y lactato deshidrogenasa; y (2) el reactivo 2 que contiene al menos un tampón de alta concentración en el intervalo de 50 a 500 mM, y un ácido biliar o su sal. 12.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que la proporción molar de tensioactivo no iónico a diglicérido está en el intervalo de 1,5 a 2,5 veces molar. 13.- Un kit de una composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que el reactivo 1 y/o el reactivo 2 está en forma líquida. 14.- Un método para determinar la actividad de las lipasas no pancreáticas utilizando la composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas según la reivindicación 4, que comprende: convertir un monoglicérido liberado de un diglicérido mediante una reacción de lipasa en glicerol mediante la acción de monoglicérido lipasa; convertir el glicerol en glicerol-3-fosfato mediante glicerol quinasa en presencia de ATP; convertir el glicerol-3-fosfato en peróxido de hidrógeno dejando actuar a la glicerol-3-fosfato oxidasa; realizar una reacción de coloración dejando actuar a la peroxidasa en presencia de un tinte que se colorea en presencia de 22   peróxido de hidrógeno; y determinar la tasa de aumento de la absorbancia a una longitud de onda de aproximadamente 540 a 700 nm. 15.- Un método para determinar la actividad de las lipasas no pancreáticas utilizando la composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas según la reivindicación 5, que comprende: convertir un monoglicérido liberado de un diglicérido mediante una reacción de lipasa en glicerol mediante la acción de monoglicérido lipasa; convertir el glicerol en ADP mediante glicerol quinasa en presencia de ATP; convertir el ADP en glucosa-6-fosfato mediante hexoquinasa dependiente de ADP en presencia de glucosa; dejar actuar a la glucosa- 6-fosfato deshidrogenasa en presencia de NAD o NADP oxidado; y determinar la tasa de aumento de la absorbancia del NAD reducido o NADP reducido a una longitud de onda de aproximadamente 340 nm. 16.- Un método para determinar la actividad de las lipasas no pancreáticas utilizando la composición para la determinación de la actividad de las lipasas no pancreáticas según la reivindicación 6, que comprende: convertir un monoglicérido liberado de un diglicérido mediante una reacción de lipasa en glicerol mediante la acción de monoglicérido lipasa; convertir el glicerol en ADP mediante glicerol quinasa en presencia de ATP; convertir el ADP en ácido pirúvico mediante piruvato quinasa en presencia de ácido fosfoenolpirúvico; dejar actuar a la lactato deshidrogenasa en presencia de NAD reducido; y determinar la tasa de disminución de la absorbancia del NAD reducido a una longitud de onda de aproximadamente 340 nm. 17.- Un método para determinar la actividad de las lipasas no pancreáticas según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que la proporción molar de tensioactivo no iónico a diglicérido es de 2,5 veces molar o mayor. 18.- Un método para determinar la actividad de la lipasa pancreática utilizando la composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática según la reivindicación 9, que comprende: convertir un monoglicérido liberado de un diglicérido mediante una reacción de lipasa en glicerol mediante la acción de monoglicérido lipasa; convertir el glicerol en glicerol-3-fosfato mediante glicerol quinasa en presencia de ATP; convertir el glicerol-3-fosfato en peróxido de hidrógeno dejando actuar a la glicerol-3-fosfato oxidasa; realizar una reacción de coloración dejando actuar a la peroxidasa en presencia de un tinte que se colorea en presencia de peróxido de hidrógeno; y determinar la tasa de aumento de la absorbancia a una longitud de onda de aproximadamente 540 a 700 nm. 19.- Un método para determinar la actividad de la lipasa pancreática utilizando la composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática según la reivindicación 10, que comprende: convertir un monoglicérido liberado de un diglicérido mediante una reacción de lipasa en glicerol mediante la acción de monoglicérido lipasa; convertir el glicerol en ADP mediante glicerol quinasa en presencia de ATP; convertir el ADP en glucosa-6-fosfato mediante hexoquinasa dependiente de ADP en presencia de glucosa; dejar actuar a la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en presencia de NAD o NADP oxidado; y determinar la tasa de aumento de la absorbancia del NAD reducido o NADP reducido a una longitud de onda de aproximadamente 340 nm. 20.- Un método para determinar la actividad de la lipasa pancreática utilizando la composición para la determinación de la actividad de la lipasa pancreática según la reivindicación 11, que comprende: convertir un monoglicérido liberado de un diglicérido mediante una reacción de lipasa en glicerol mediante la acción de monoglicérido lipasa; convertir el glicerol en ADP mediante glicerol quinasa en presencia de ATP; convertir el ADP en ácido pirúvico mediante piruvato quinasa en presencia de ácido fosfoenolpirúvico; dejar actuar a la lactato deshidrogenasa en presencia de NAD reducido; y determinar la tasa de disminución de la absorbancia del NAD reducido a una longitud de onda de aproximadamente 340 nm. 21.- Un método para determinar la actividad de la lipasa pancreática según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que la proporción molar de tensioactivo no iónico a diglicérido está en el intervalo de 1,5 a 2,5 veces molar. 22.- Un método para determinar la actividad lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en el que el reactivo 1 y/o el reactivo 2 en una composición para la determinación de la actividad lipasa está en forma líquida. 23   24     26   27