Un anticuerpo anti-DR5 que comprende mutaciones en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de longitud completa 16E2 como se establece en las SEQ ID NO.

1 y 13, respectivamente, o un fragmento del mismo, en el que: dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad mayor por DR5 que el anticuerpo de longitud completa 16E2 y es capaz de activar o estimular la apoptosis en células cancerosas y las mutaciones comprenden: (i) un conjunto de mutaciones de la cadena pesada seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) N53Q, L102Y; (ii) M34L, N53Q, L102Y; (iii) N53Y, L102Y; (iv) M34L, N53Y, L102Y; (v) G33A, N53Q, L102Y; (vi) M34L, N53Y, L102Y; (vii) G33A, N53Y, L102Y; (viii) T28A, N53Q, L102Y y (ix) T28A, N53Y, L102Y en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 y (ii) un conjunto de mutaciones de la cadena ligera seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) Q24S, G50K, K51D, N52S, N53E, H95bY; (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y y (iii) Q24S, K51A, R91A en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13

Anticuerpos frente a dr5 y sus usos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos frente a DR5, incluyendo anticuerpos agonistas, y a procedimientos de uso de dichos anticuerpos frente a DR5.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la técnica se han identificado diversos ligandos y receptores pertenecientes a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) . Entre estos ligandos se incluyen el factor de necrosis tumoral alfa ("TNF alfa") , el factor de necrosis tumoral beta ("TNF beta" o “linfotoxina alfa”) , linfotoxina beta ("LT beta) , ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, LIGHT, ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95) , ligando Apo-2 (también denominado como Apo2L y TRIAL) , ligando Apo-3 (también denominado como TWEAK) . APRIL, ligando OPG (también denominado ligando RANK, ODF o TRANCE) y TALL-1 (también denominado como BlyS, BAFF o THANK) (véase, p. ej., Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002) ; Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998) ; Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000) ; Golstein, Curr Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001) ; Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995) ; Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986) ; Dealtr y y col., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987) ; Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996) ; Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995) ; Browsing y col., Cell, 72:847-856 (1993) ; Armitage y col. Nature, 357:80-82 (1992) , documento WO 97/01633 publicado el 16 de enero de 1997; documento WO 97/25428 publicado el 17 de julio de 1997; Marsters y col., Curr. Biol., 8:525-528 (1998) ; Chicheportiche y col., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997) ; Hahne y col., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998) ; documento WO98/28426 publicado el 2 de julio de 1998; documento WO98/4675 publicado el 22 de octubre de 1998; documento WO/98/18921 publicado el 7 de mayo de 1998; Moore y col., Science, 285:260-263 (1999) ; Shu y col., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999) ; Schneider y col., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999) ; Mukhopadhyay y col., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999) ) .

Típicamente, la inducción de diversas respuestas celulares mediadas por estos ligandos de la familia del TNF se inicia por su unión a receptores celulares específicos. Algunos, pero no todos, los ligandos de la familia del TNF se unen e inducen diversas actividades biológicas a través de "receptores de muerte" de la superficie celular activando caspasas o enzimas que participan en la ruta de muerte celular o apoptosis (Salvesen y col., Cell, 91:443446 (1997) . Los miembros incluidos en la superfamilia de receptores del TNF identificados hasta la fecha son TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (también denominado Apo-1 o CD95) , DR4 (también denominado TRAIL-R1) , DR5 (también denominado Apo-2 o TRAIL-R2) , DcR1, DcR2, osteoprotegerina (OPG) , RANK y Apo-3 (también denominado DR3 o TRAMP) (véase, p. ej., Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002) ; Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998) ; Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000) ; Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001) ; Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995) ; Hohman y col., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989) ; Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990) ; documento EP 417.563, publicado el 20 de marzo de 1991; Loetscher y col., Cell, 61:351 (1990) ; Schall y col., Cell, 61:361 (1990) ; Smith y col., Science, 248:1019-1023 (1990) ; Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991) ; Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991) ; Stamenkovic y col., EMBO J., 8:1403-1410 (1989) ; Mallet y col., EMBO J., 9:1063-1068 (1990) ; Anderson y col., Nature, 390:175-179 (1997) ; Chicheportiche y col., J. Biol. Chem., 272:3240132410 (1997) ; Pan y col., Science, 276:111-113 (1997) ; Pan y col., Science, 277:815-818 (1997) ; Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997) ; Degli-Esposti y col., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997) ; Marsters y col., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997) ; Tsuda y col., BBRC, 234:137-142 (1997) ; Nocentini y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997) ; vonBulow y col., Science, 278:138-141 (1997) ) .

La mayoría de estos miembros de la familia de receptores del TNF comparten la estructura típica de receptores de superficie celular con regiones extracelular, transmembrana e intracelular, mientras que otros se encuentran de forma natural como proteínas solubles carentes de dominio transmembrana e intracelular. La porción extracelular de los TNFR típicos contiene un patrón repetitivo de secuencia de aminoácidos de dominios múltiples ricos en cisteína (DRC) que empiezan desde el NH2 terminal.

El ligando denominado Apo-2L o TRAIL se identificó hace varios años como miembro de la familia de citoquinas TNF. (véase, p. ej. Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995) ; Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996) ; documentos WO 97/01633 y WO 97/25428; patente de EE. UU. Nº 5.763.223 presentada el 9 de junio de 1998; patente de EE. UU. Nº 6.284.236 presentada el 4 de septiembre de 2001) . La secuencia polipeptídica nativa completa de Apo2L/TRAIL es una proteína transmembrana de tipo II de 281 aminoácidos. Algunas células pueden producir una forma soluble natural del polipéptido, mediante la escisión enzimática de la región extracelular polipeptídica (Mariani y col., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997) ) . Los estudios cristalográficos de las formas solubles de Apo2L/TRAIL, muestran una estructura homotrimérica similar a las estructuras del TNF y otras proteínas relacionadas (Hymowitz y col., Molec. Cell, 4:563-571 (1999) ; Cha y col., Immunity, 11:253-261 (1999) ; Mongkolsapaya y col., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999) ; Hymowitz y col., Biochemistr y , 39:633-644 (2000) ) . Sin embargo, se ha encontrado que Apo2L/TRIAL, a diferencia de otros miembros de la familia del TNF, tiene una característica estructural exclusiva en tres restos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad del homotrímero) coordinados conjuntamente con un átomo de cinc y que la unión al cinc es importante para la estabilidad del trímero y la actividad biológica (Hymowitz y col., supra; Bodmer y col., J. Biol. Chem., 275:2063220637 (2000) ) .

Se ha publicado en la literatura que Apo2L/TRIAL puede tener una función principal en la modulación del sistema inmune, incluso en enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide [véase, p. ej., Thomas y col., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998) ; Johnsen y col., Cytokine, 11:664-672 (1999) ; Griffith y col., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999) ; Song y col., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000) ].

También se ha publicado que las formas solubles de Apo2L/TRAIL inducen la apoptosis en diversas células cancerígenas, como tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñón, ovario y cerebro, así como melanoma, leucemia y mieloma múltiple (véase, p. ej., Wiley y col., supra; Pitti y col., supra; patente de EE. UU. Nº

6.030.945 presentada el 29 de febrero de 2000; patente de EE. UU. Nº 6.746.668 presentada el 8 de junio de 2004; Rieger y col., FEBS Letters, 427:124-128 (1998) ; Ashkenazi y col., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999) ; Walczak y col., Nature Med., 5:157-163 (1999) ; Keane y col., Cancer Research, 59:734-741 (1999) ; Mizutani y col., Clin Cancer Res., 5:2605-2612 (1999) ; Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999) ; Yu y col., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000) ; Chinnaiyan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000) ) . Los estudios in vivo en modelos de tumores murinos sugieren además que Apo2L/TRIAL, solo o en combinación con quimioterapia o radioterapia, puede ejercer efectos antitumorales sustanciales (véase, p. ej., Ashkenazi y col., supra; Walzcak y col., supra; Gliniak y col., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999) ; Chinnaiyan y col., supra; Roth y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999) ; solicitud de patente US/00/15512; solicitud de patente US/01/23691) . Al contrario que muchos tipos de células cancerosas, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen resistentes a la inducción de apoptosis mediante determinadas formas recombinantes de Apo2L/TRIAL (Ashkenazi y col., supra; Walzcak y col., supra) . Jo y col. han publicado que una forma soluble etiquetada con polihistidina de Apo2L/TRIAL inducía apoptosis in vitro en hepatocitos humanos normales... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-DR5 que comprende mutaciones en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de longitud completa 16E2 como se establece en las SEQ ID NO. 1 y 13, respectivamente, o un fragmento del mismo, en el que:

dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad mayor por DR5 que el anticuerpo de longitud completa 16E2 y es capaz de activar o estimular la apoptosis en células cancerosas y las mutaciones comprenden:

(i) un conjunto de mutaciones de la cadena pesada seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) N53Q, L102Y;

(ii) M34L, N53Q, L102Y; (iii) N53Y, L102Y; (iv) M34L, N53Y, L102Y; (v) G33A, N53Q, L102Y; (vi) M34L, N53Y, L102Y; (vii) G33A, N53Y, L102Y; (viii) T28A, N53Q, L102Y y (ix) T28A, N53Y, L102Y en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 y

(ii) un conjunto de mutaciones de la cadena ligera seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) Q24S, G50K, K51D, N52S, N53E, H95bY; (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y y (iii) Q24S, K51A, R91A en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13.

2. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une esencialmente al mismo epítope que el anticuerpo 16E2 de longitud completa.

3. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 que comprende una o más mutaciones en la región estructural del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo 16E2 de longitud completa en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 o un fragmento de la misma.

4. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 3 en el que la mutación de la región estructural se selecciona entre el grupo compuestos por Q6E, V11L, E12V, R13Q y K105Q o un fragmento del mismo.

5. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 4 que comprende todas las mutaciones de la región estructural de Q6E, V11L, E12V, R13Q y K105Q o un fragmento del mismo.

6. El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende al menos una de las mutaciones G99A y R100A en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 o un fragmento del mismo.

7. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 que comprende las mutaciones siguientes: G33A, N53Q, L102Y en la secuencia de la SEQ ID NO. 11 y Q24S, K51A, R91A en la secuencia de la SEQ ID NO. 13 o un fragmento del mismo.

8. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 que comprende las mutaciones siguientes: G33A, N53Y, L102Y en la secuencia de la SEQ ID NO. 11 y Q24S, K51A, R91A en la secuencia de la SEQ ID NO. 13 o un fragmento del mismo.

9. El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento se selecciona entre el grupo compuesto por fragmentos Fab, Fab', (F (ab') 2 y Fv, dianticuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.

10. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 9 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.

11. El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 9 en el que dicho fragmento es un fragmento Fv.

12. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el anticuerpo tiene una actividad antineoplásica mayor que el anticuerpo de longitud completa 16E2.

13. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo tiene una potencia mayor que el anticuerpo 16E2 de longitud completa según se determina en un ensayo de muerte tumoral in vitro.

14. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

15. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que media en la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) .

16. El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en forma dimérica o un fragmento del mismo.

17. El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes entrecruzado con una región Fc de una IgG antihumana o un fragmento del mismo.

18. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes fusionado con una secuencia epítope etiqueta.

19. Una molécula quimérica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes fusionada a una secuencia de aminoácidos heteróloga.

20. La molécula quimérica de la reivindicación 19 en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga comprende una secuencia de inmunoglobulina.

21. La molécula quimérica de la reivindicación 20 en la que dicha secuencia de inmunoglobulina es una región Fc de una IgG anti-humano.

22. Un anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en terapia.

23. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 22, en el que la terapia es el tratamiento del cáncer.

24. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 23, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.

25. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 23, en el que dicho cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por carcinoma epidermoide, cáncer microcítico pulmonar, cáncer pulmonar no microcítico (CPNM) , linfoma no Hodgkin, blastoma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y cáncer de cabeza y cuello.

26. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 25, en la que dicho cáncer es CPNM, linfoma no Hodgkin, cáncer colorrectal o cáncer pancreático.

27. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 24, en el que dicho cáncer es un adenocarcinoma.

28. El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 27, en el que dicho adenocarcinoma es adenocarcinoma colorrectal, pancreático o metastásico.

29. El ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

30. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 29.

31. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 30.

32. Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 31 en las condiciones en la que se expresa el ADN.

33. Una composición que comprende un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, o un fragmento del mismo, y un vehículo.

34. La composición de la reivindicación 33 en la que dicho vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

35. La composición de la reivindicación 34 que además comprende un agente antineoplásico adicional.

36. La composición de la reivindicación 35 en la que dicho agente antineoplásico adicional es un anticuerpo.

37. La composición de la reivindicación 36 en la que dicho anticuerpo se selecciona entre el grupo compuesto por un anticuerpo anti-DR5, Rituxan (rituximab) y un anticuerpo anti-VEGF.

38. La composición de la reivindicación 35 en la que dicho agente antineoplásico adicional es un agente quimioterapéutico.

39. La composición de la reivindicación 38 en la que dicho agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo compuesto por CPT-II (irinotecán) , gemcitabina, carboplatino, taxol y paclitaxel.

40. La composición de la reivindicación 39 en la que dicho agente antineoplásico adicional es un ligando Apo2L que comprende los aminoácido.

11. 281 de la SEQ ID NO. 1.

41. Un procedimiento ex vivo de inducción de apoptosis que comprende exponer a las células cancerosas de mamífero a un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, o un fragmento del mismo.

42. El procedimiento de la reivindicación 14 en el que dichas células cancerosas de mamífero se exponen a un agente que activa DR5.

43. Uso de un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, o un fragmento del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un sujeto mamífero.

44. El uso de la reivindicación 43, en la que el sujeto mamífero es un paciente humano.

45. El uso de la reivindicación 43 o de la reivindicación 44, en el que dicho cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por carcinoma epidermoide, cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico (CPNM) , linfoma no Hodgkin, blastoma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y cáncer de cabeza y cuello.

46. El uso de la reivindicación 45 en el que dicho cáncer es CPNM, cáncer colorrectal, linfoma no Hodgkin

o cáncer pancreático.

47. El uso de la reivindicación 43 o de la reivindicación 44 en el que dicho cáncer es un adenocarcinoma.

48. El uso de la reivindicación 47 en la que dicho adenocarcinoma es adenocarcinoma colorrectal, pancreático o metastático.

49. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, que comprende adicionalmente la administración de un agente antineoplásico más.