Un anticuerpo anti-NGF humanizado, o un fragmento del mismo que mantiene la actividad de unión a NGF,

que comprende una región VH que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 17 y una región VL que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 18.

Anticuerpos anti-NGF humanizados

Antecedentes

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-NGF humanizados.

La aplicación terapéutica y de diagnóstico de anticuerpos monoclonales de origen animal en seres humanos tiene contraindicaciones fundamentales, especialmente para regimenes terapéuticos que necesitan administraciones repetidas. En particular, los anticuerpos monoclonales murinos tienen una semivida relativamente corta y, cuando se usan en seres humanos, carecen de algunas características funcionales fundamentales de las inmunoglobulinas, tales como citotoxicidad dependiente del complemento y citotoxicidad mediada por células.

Además, los anticuerpos monoclonales de origen no humano contienen secuencias de aminoácidos inmunogénicas si se inyectan en pacientes. Numerosos estudios han demostrado que después de la inyección de un anticuerpo exógeno, los sujetos desarrollan una reacción inmune más bien fuerte contra el propio anticuerpo (conocida como reacción HAMA -siglas en inglés de anticuerpos humanos anti-ratón) , eliminando completamente su utilidad terapéutica, con la formación de complejos inmunes, la alteración de la farmacocinética, la producción de reacciones alérgicas, etc. Además, considerando el número creciente de anticuerpos monoclonales diferentes desarrollados en ratones o en otros mamíferos (y, por lo tanto, antigénicos para seres humanos) para la terapia de diferentes patologías, los tratamientos, también para terapias no correlacionadas, pueden ser ineficaces o incluso peligrosos debido a la reactividad cruzada. Aunque la producción de los denominados anticuerpos quiméricos (regiones murinas variables unidas a regiones constantes de origen humano) ha producido algún resultado positivo, sigue habiendo un problema de inmunogenicidad significativo.

Los anticuerpos humanizados tienen al menos tres ventajas potenciales con respecto a los anticuerpos de origen animal en el campo del uso terapéutico en seres humanos. En primer lugar, la región efectora, al ser humana, puede interaccionar mejor con las otras partes del sistema inmune humano, destruyendo las células diana más eficazmente por medio de citotoxicidad dependiente del complemento o citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células. Además, el sistema inmune humano no reconoce la región marco o la región constante (C) del anticuerpo humanizado como exógena, y por lo tanto la respuesta de anticuerpos contra el anticuerpo humanizado se minimiza, tanto en relación con la respuesta contra un anticuerpo murino (totalmente extraño) como en relación con la respuesta inducida por un anticuerpo quimérico (parcialmente extraño) .

Se ha notificado que los anticuerpos murinos inyectados en seres humanos tienen una semivida mucho más corta que los anticuerpos normales (Shaw et al., 1987) . Los anticuerpos humanizados tienen una semivida muy similar a la de los anticuerpos humanos naturales, lo que permite una administración menos frecuente y dosis menores.

El principio básico de la humanización se configura transfiriendo la especificidad del reconocimiento de antígeno, es decir, los dominios de CDR, en el contexto de una inmunoglobulina humana ("CDR grafting", Winter y Milstein, 1991) . Se han presentado varios ejemplos de anticuerpos humanizados, producidos con la intención de solucionar el problema de la inmunogenicidad (Maeda et al., 1991; Singer et al., 1993; Tempest et al., 1994; Kettleborough et al., 1991; Hsiao et al., 1994; Baca et al., 1997; Leger et al., 1997; Ellis et al., 1995; Sato et al., 1994; Jones et al., 1986; Benhar et al., 1994; Sha y Xiang, 1994; Shearman et al., 1991; Rosok et al., 1996; Gussow & Seemann, 1991; Couto et al., 1994; Kashmiri et al., 1995; Baker et al., 1994; Riechmann et al., 1988; Gorman et al., 1991; Verhoeyen et al., 1988; Foote & Winter, 1992; Lewis & Crowe, 1991; Co et al., 1991; Co et al., 1991; Verhoeyen et al., 1991; Eigenbrot et al., 1994; Hamilton et al., 1997; Tempest et al., 1995; Verhoeyen et al., 1993; Cook et al., , 1996; Poul et al., 1995; Co et al., 1992; Graziano et al., 1995; Presta et al., 1993; Hakimi et al., 1993; Roguska et al., 1996; Adair et al., 1994; Sato et al., 1993; Tempest et al., 1991; Sato et al., 1996; Kolbinger et al., 1993; Zhu y Carter, 1995; Sims et al., 1993; Routledge et al., 1991; Roguska et al., 1994; Queen et al., 1989; Carter et al., 1992) .

La transcripción de un anticuerpo desde animal (generalmente murino) a humanizado implica el compromiso entre requisitos opuestos, cuya solución varía de un caso a otro. Para minimizar la inmunogenicidad, la inmunoglobulina deberá mantener tanta cantidad de secuencia humana aceptora como sea posible. En cualquier caso, para conservar las propiedades de unión originales, la región marco de la inmunoglobulina debe contener un número suficiente de mutaciones en la secuencia humana aceptora como para garantizar que la conformación de las regiones CDR es tan similar como sea posible a la de la inmunoglobulina murina donadora. Como consecuencia de estas consideraciones opuestas, para muchos anticuerpos humanizados se ha notificado una pérdida significativa en afinidad de unión con respecto a los anticuerpos murinos correspondientes (Jones et al., 1986; Shearman et al., 1991; Kettleborough, 1991; Gorman et al., 1991; Riechmann et al., 1988) .

Actualmente, el método más común para la producción de inmunoglobulinas humanizadas se basa en el uso de secuencias genómicas sintéticas apropiadas, así como ADNc (Reichmann et al., 1988) .

La solicitud de patente EP 592106 describe un método para la humanización de anticuerpos procedentes de roedores. El método se basa en la identificación de los restos de aminoácido expuestos en la superficie de la estructura tridimensional del anticuerpo a humanizar, en la identificación de los restos de aminoácido en las mismas posiciones en el anticuerpo humano correspondiente, y en el reemplazo de los restos identificados en la secuencia del anticuerpo de roedor por los identificados en el anticuerpo humano.

El documento WO 01/10203 describe animales transgénicos no humanos como sistemas modelo para patologías humanas, en particular ratones transgénicos que producen anticuerpo anti-NGF (Factor de Crecimiento Nervioso) y que pueden imitar diferentes patologías tales como síndromes neurodegenerativos.

El documento WO 02/096458 describe métodos para usar anticuerpos anti-NGF en el tratamiento de diversos trastornos relacionados con NGF, incluyendo asma, artritis y psoriasis.

Descripción de la invención

Los presentes inventores establecen un método para obtener formas humanizadas optimizadas de inmunoglobulinas que son sustancialmente no inmunogénicas en seres humanos, con una estrategia que se basa sistemáticamente en datos estructurales, obtenidos experimentalmente, procedentes de estudios cristalográficos. El método permite obtener anticuerpos en una forma adaptada a la formulación terapéutica y a otras aplicaciones médicas y de diagnóstico.

El método se basa completamente en datos estructurales para realizar las primeras etapas del diseño (en general más sujetas a error) de humanización. Las inmunoglobulinas humanizadas tienen dos pares de heterodímeros entre la cadena ligera y pesada, llevando al menos una de las cadenas una o más CDR de origen animal, unidas funcionalmente a segmentos de regiones de la región marco de origen humano. Por ejemplo, CDR de origen animal, junto con restos de aminoácido, asociados naturalmente, también de origen animal, se introducen en regiones marco de origen humano, para producir inmunoglobulinas humanizadas capaces de unirse a los antígenos respectivos, con afinidades comparables a las afinidades de las inmunoglobulinas originales de origen animal.

Usando este método, los inventores obtuvieron anticuerpos humanizados adecuados para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. En particular, se han obtenido inmunoglobulinas humanizadas, derivadas de anticuerpos anti-NGF capaces de unirse con alta especificidad a NGF, neutralizando la interacción entre el ligando y los receptores.

Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo anti-NGF humanizado, o un fragmento del mismo que mantiene la actividad de unión a NGF, que comprende una región VH que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 17 y una región VL que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 18. Dichos anticuerpos son útiles para el tratamiento de tumores que dependen de NGF/TrkA, del dolor crónico y de formas de inflamación. En particular, los anticuerpos anti-NGF humanizados... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-NGF humanizado, o un fragmento del mismo que mantiene la actividad de unión a NGF, que comprende una región VH que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 17 y una región VL que tiene la secuencia de la SEC ID Nº : 18.

2. El fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que es un fragmento Fab, un fragmento (Fab') 2, un fragmento Fv

o un fragmento Fv monocatenario (scFv) .

3. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NGF humanizado o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico para prevenir o reducir el componente inflamatorio asociado con situaciones patológicas o dolor crónico.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en el tratamiento de un tumor de próstata o páncreas o patologías inducidas por VIH.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en combinación con otro agente terapéutico, que incluye antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, inmunosupresores o un agente antitumoral tal como antraciclina, paclitaxel, cisplatino o gemcitabina.

7. Uso de un anticuerpo anti-NGF humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la preparación de una composición farmacéutica para uso en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico para prevenir o reducir el componente inflamatorio asociado con situaciones patológicas o dolor crónico o para uso en el tratamiento de un tumor de próstata o páncreas o patologías inducidas por VIH.

8. Una secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo anti-NGF humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

9. Una célula que expresa la secuencia polinucleotídica de la reivindicación 8, en la que la célula es una célula procariota o una línea celular eucariota inmortalizada.

10. El anticuerpo anti-NGF humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo está marcado por un radionúclido, fluoróforo, colorante, enzima, sustrato enzimático, factor enzimático, inhibidor enzimático o ligando.