Procedimientos para identificar regiones de unión a macromolécula y propensas a la agregación en proteínas y usos de los mismos.

Un procedimiento implementado por ordenador para identificar una región propensa a la agregación y/o una región de unión a macromolécula sobre una proteína que comprende (a) mapear,

sobre un modelo estructural de la proteína, la propensión a la agregación espacial, SAP, para átomos en la proteína como se calcula para un átomo particular

(i) identificando uno o más átomos o residuos de aminoácidos en un modelo estructural que representa la proteína, en el que el uno o más átomos están dentro de una región espacial definida centrada en o próxima al átomo particular o el uno o más residuos de aminoácidos tienen uno o más átomos dentro de una región espacial definida centrada en o próxima al átomo particular;

(ii) calculando, para el uno o más átomos en la región espacial definida, una relación del área accesible al disolvente, SAA, de los átomos con respecto al SAA de átomos en un residuo idéntico que está completamente expuesto;

(iii) multiplicando cada relación por la hidrofobia del átomo del uno o más átomos o la hidrofobia del uno o más residuos de aminoácidos como se ha determinado por una escala de hidrofobia de aminoácidos; y

(iv) sumando los productos de la etapa (iii); por lo que la suma es la SAP para el átomo particular; o en el que la SAP para el átomo particular se calcula realizando una simulación de dinámica molecular antes de la etapa (i) y repitiendo las etapas (i) - (iv), realizando cada vez otra simulación de dinámica molecular en una pluralidad de etapas de tiempo, produciendo así múltiples sumas como en la etapa (iv), y calculando el promedio de las sumas; por lo que el promedio calculado es la SAP para el átomo particular; y (b) identificar una región dentro de la proteína que tiene una pluralidad de átomos que tiene una SAP >0; en el que la región propensa a la agregación y/o región de unión a macromolécula comprende los aminoácidos que comprenden dicha pluralidad de átomos.

Procedimientos para identificar regiones de unión a macromolécula y propensas a la agregación en proteínas y usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El entendimiento y el control de la estabilidad de proteínas ha sido un empeño codiciado para biológicos, químicos e ingenieros. El primer vínculo entre sustitución de aminoácidos y enfermedad (Ingram. Nature. 1957, 180 (4581) :3268) ofreció una perspectiva nueva y esencial de la estabilidad de las proteína en salud y enfermedad. El reciente enorme aumento de productos farmacéuticos basados en proteínas ha supuesto un nuevo reto. Las proteínas terapéuticas se almacenan en líquido durante varios meses a concentraciones muy altas. El porcentaje de especies no monoméricas aumenta con el tiempo. Como forma agregada, no solo disminuye la eficacia del producto, sino que pueden producirse efectos secundarios tales como respuesta inmunológica tras la administración. El asegurar la estabilidad de los productos farmacéuticos de proteína para la estabilidad en almacén del producto es imprescindible.

Debido a su potencial en la cura de diversas enfermedades, los anticuerpos actualmente constituyen la clase más rápidamente creciente de productos terapéuticos humanos (Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6 (5) , 343) . Desde 2001, su mercado ha ido creciendo a una tasa de crecimiento promedio anual del 35%, la mayor tasa entre todas las categorías de fármacos biotecnológicos (S. Aggarwal, Nature. BioTech. 2007, 25 (10) 1097) .

Los anticuerpos terapéuticos se preparan y se guardan en disoluciones acuosas a altas concentraciones, según se requiera para el tratamiento de enfermedad. Sin embargo, estos anticuerpos son termodinámicamente inestables bajo estas condiciones y se degradan debido a agregación. La agregación conduce a su vez a una disminución en la actividad del anticuerpo, haciendo el fármaco ineficaz y puede incluso generar una respuesta inmunológica. Como tal, hay una necesidad urgente de desarrollar un entendimiento mecanístico de cómo estos anticuerpos, y de hecho proteínas en general, se agregan, para descubrir qué regiones de la proteína participan en la agregación, y para desarrollar estrategias para impedir la agregación.

Estos efectos son particularmente importantes para agentes terapéuticos de anticuerpos. Un enfoque para la estabilización de anticuerpos es injertar los bucles de CDR que confieren especificidad de unión a antígeno sobre una región estructural más estable (Ewert, Honegger y Pluckthun, Biochemistr y . 2003, 42 (6) : 1517-28) . Este enfoque solo funcionará si la secuencia de aminoácidos en los bucles de CDR no es la fuerza de agregación motora, y si el injerto de los bucles de CDR sobre una región estructural más estable no cambia la especificidad de unión a antígeno.

La tecnología relacionada con predecir regiones propensas a la agregación de proteínas puede dividirse en dos categorías, 1) modelos fenomenológicos y 2) técnicas de simulación molecular. Los modelos fenomenológicos se basan principalmente en predecir los 'puntos calientes' de agregación de secuencias primarias de proteínas usando propiedades tales como hidrofobia, propensión a hojas 1, etc., mientras que las técnicas de simulación molecular usan la estructura tridimensional y la dinámica de proteínas para localizar las regiones propensas a la agregación. La mayoría de las técnicas se han dirigido al entendimiento de la formación de fibrillas amiloides y agregación de otras proteínas pequeñas en las que la formación de hojas 1 es predominante.

Se han desarrollado modelos fenomenológicos basados en propiedades fisicoquímicas tales como hidrofobia, propensión a hojas 1, etc., para predecir las regiones propensas a la agregación de la secuencia primaria de proteínas (Caflisch, Current Opinion in Chemical Biology. 2006, 10, 437-444; Chiti y Dobson. Annu. Rev. Biochem, 2006, 75: 333-366) . Uno de los modelos fenomenológicos iniciales se basó en estudios mutacionales de la cinética de agregación de una proteína globular pequeña 'acilfosfatasa de músculo humano' (AcP) junto con otros péptidos sin estructurar y proteínas nativamente desplegadas (Chiti y col. Nature. 2003, 424 pág. 805-808; patente de EE.UU. nº 7379824]. Este estudio reveló simples correlaciones entre la agregación y las propiedades fisicoquímicas tales como propensión a hojas 1, hidrofobia y carga. Estos estudios se hicieron en condiciones a las que las proteínas están principalmente sin estructurar. Así, se desarrolló un modelo empírico de tres parámetros que enlaza la secuencia con la propensión a la agregación (Chiti y col. Nature. 2003, 424, 805-808) . Este modelo también se usó para sugerir variantes de la hormona peptídica de 32 residuos calcitonina para reducir su propensión a la agregación (Fowler y col. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102, 10105-10110) . DuBay y colaboradores han extendido la ecuación de tres parámetros (Chiti y col. Nature. 2003, 424, 805-808) a una fórmula de siete parámetros que incluye propiedades intrínsecas de la cadena de polipéptidos y factores extrínsecos relacionados con el entorno tal como concentración de péptido, valor de pH y fuerza iónica de la disolución (Dubay y col. J Mol Biol. 2004, 341, 13171326) . Usando este modelo pudieron reproducir las tasas de agregación in vitro de un amplio intervalo de péptidos y proteínas sin estructurar. Sin embargo, la principal limitación del modelo de siete parámetros es que a todos los residuos en la secuencia se les dio la misma importancia relativa. Esto no es coherente con observación experimental y de simulaciones que muestra que ciertas regiones son más importantes que otras, dependiendo de sus propensiones de la estructura secundaria. Recientemente, este análisis se extendió adicionalmente para incluir factores de protección para describir la agregación de cadenas de polipéptidos estructuradas (Tartaglia, G. G.,

Pawar, A. P., Campioni, S, Dobson, C. M., Chiti, F. y Vendruscolo, M. J Mol Biol (2008) en prensa) . Algunos de los sitios predichos estuvieron de acuerdo con los sitios propensos a la agregación conocidos para proteínas tales como lisozima, mioglobina, etc. Se desarrolló un modelo fenomenológico sin parámetros libres (Tartaglia y col. Protein Sci. 2004, 13, 1939-1941; Tartaglia y col. Protein Sci. 2005, 14, 2723-2734) para predecir cambios en la tasa de alargamiento de la fibrilla de agregados tras la mutación e identificar segmentos propensos a la agregación. Las propiedades fisicoquímicas usadas son el cambio en la propensión a 1 tras la mutación, el cambio en el número de residuos aromáticos y el cambio en la carga total. Además, la relación de área superficial accesible se tiene en cuenta si las cadenas laterales naturales y mutantes son ambas polares o ambas apolares, mientras que el momento dipolar de la cadena lateral polar se usa en el caso de mutación apolar a polar (o polar a apolar) . Este modelo reprodujo la propensión relativa a la agregación de un conjunto de 26 secuencias de heptapéptidos, que se predijo que favorecieron una disposición de hoja 1 paralela en registro.

El modelo de DuBay y colaboradores (Dubay y col. J Mol Biol. 2004, 341, 1317-1326) ha sido modificado con la inclusión de propensión helicoidal a y modelado hidrófobo, y comparando la puntuación de propensión a la agregación de una secuencia de aminoácidos dada con una propensión promedio calculada para un conjunto de secuencias de longitud similar (Pawar y col., J Mol Biol. 2005, 350, 379-392) . Este modelo se ha validado sobre los segmentos propensos a la agregación de tres cadenas de polipéptidos nativamente desplegados: A142, a-sinucleína y la proteína tau.

Se desarrolló otro algoritmo llamado TANGO (Fernandez-Escamilla y col., Nat Biotechnol. 2004, 22, 1302-1306) , que equilibra los mismos parámetros fisicoquímicos, complementados por la suposición de que un aminoácido está completamente enterrado en el estado agregado. Esto se basa en la propensión de la estructura secundaria y estimación de penalización por desolvatación para predecir regiones de agregación 1 de una secuencia de proteínas, además de efectos mutacionales. A diferencia de los modelos tratados anteriormente, TANGO tiene en cuenta la estabilidad en estado nativo usando el campo de fuerza FOLD-X. Aunque no es posible calcular tasas absolutas de agregación con TANGO, proporciona una comparación cualitativa entre péptidos o proteínas que se diferencian significativamente en secuencia. Serrano y colaboradores (Linding y col., J Mol Biol. 2004, 342, 345-353) han usado TANGO para analizar la propensión a la agregación 1 de un conjunto de proteínas globulares no redundantes con un límite superior del 40% de identidad de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento implementado por ordenador para identificar una región propensa a la agregación y/o una región de unión a macromolécula sobre una proteína que comprende (a) mapear, sobre un modelo estructural de la proteína, la propensión a la agregación espacial, SAP, para átomos en la proteína como se calcula para un átomo particular

(i) identificando uno o más átomos o residuos de aminoácidos en un modelo estructural que representa la proteína, en el que el uno o más átomos están dentro de una región espacial definida centrada en o próxima al átomo particular o el uno o más residuos de aminoácidos tienen uno o más átomos dentro de una región espacial definida centrada en o próxima al átomo particular;

(ii) calculando, para el uno o más átomos en la región espacial definida, una relación del área accesible al disolvente, SAA, de los átomos con respecto al SAA de átomos en un residuo idéntico que está completamente expuesto;

(iii) multiplicando cada relación por la hidrofobia del átomo del uno o más átomos o la hidrofobia del uno o más residuos de aminoácidos como se ha determinado por una escala de hidrofobia de aminoácidos; y

(iv) sumando los productos de la etapa (iii) ; por lo que la suma es la SAP para el átomo particular; o en el que la SAP para el átomo particular se calcula realizando una simulación de dinámica molecular antes de la etapa (i) y repitiendo las etapas (i) - (iv) , realizando cada vez otra simulación de dinámica molecular en una pluralidad de etapas de tiempo, produciendo así múltiples sumas como en la etapa (iv) , y calculando el promedio de las sumas; por lo que el promedio calculado es la SAP para el átomo particular; y (b) identificar una región dentro de la proteína que tiene una pluralidad de átomos que tiene una SAP > 0; en el que la región propensa a la agregación y/o región de unión a macromolécula comprende los aminoácidos que comprenden dicha pluralidad de átomos.

2. El procedimiento implementado por ordenador de la reivindicación 1, en el que la identificación comprende representar los valores de SAP; calcular, para picos en la representación, el área bajo la curva, ABC; e identificar una o más regiones de proteína con un ABC positiva, en el que la región propensa a la agregación y/o región de unión a macromolécula comprende las regiones de proteína identificadas.

3. El procedimiento implementado por ordenador de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en un procedimiento de preparación de una variante de proteína que presenta una propensión reducida a la agregación y/o afinidad de unión alterada por una macromolécula, en el que el procedimiento de preparación de una variante de proteína comprende sustituir o delecionar al menos un residuo de aminoácido dentro de una región propensa a la agregación en la proteína, en el que la región propensa a la agregación se identifica usando puntuaciones de SAP calculadas según la reivindicación 1; y en el que, si el residuo de aminoácido se sustituye, se sustituye con un residuo de aminoácido que es más hidrófilo, de forma que se reduce la propensión a la agregación de la variante y/o la afinidad de unión por la macromolécula de la variante.

4. El procedimiento implementado por ordenador de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en un procedimiento de preparación de una variante de proteína que presenta una propensión reducida a la agregación y/o afinidad de unión alterada por una macromolécula, en el que el procedimiento de preparación de una variante de proteína comprende

(a) generar una pluralidad de variantes de proteína sustituyendo en cada variante al menos un residuo dentro de una región propensa a la agregación en la proteína, en el que la región propensa a la agregación se identifica usando puntuaciones de SAP calculadas según la reivindicación 1, en el que un residuo o residuos diferentes, o combinaciones diferentes de residuos, se sustituyen en cada variante; en el que el al menos un residuo se sustituye con un residuo que es más hidrófilo; y

(b) seleccionar una variante de proteína preparada como en (a) que presenta una propensión reducida a la agregación y/o que presenta una afinidad de unión alterada por la macromolécula.

5. El procedimiento implementado por ordenador de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que se sustituyen al menos dos residuos de aminoácidos dentro de la región propensa a la agregación y/o región de unión a macromolécula.

6. El procedimiento implementado por ordenador de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que al menos un residuo se sustituye dentro de más de una región propensa a la agregación y/o más de una región de unión a macromolécula dentro de la proteína.

7. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 6, en el que la proteína está

seleccionada del grupo constituido por un anticuerpo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F (ab') 2 y un fragmento Fc.

8. Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que comprende una variante de proteína

que presenta una propensión reducida a la agregación y/o una propensión reducida para la interacción con un componente de unión, que comprende formular una variante de proteína obtenida según el procedimiento de la reivindicación 3 o la reivindicación 4 junto con un vehículo, adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Un medio legible por ordenador que comprende instrucciones, que cuando se ejecuta hace que un procesador 10 lleve a cabo el procedimiento implementado por ordenador según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.