Un anticuerpo aislado que une hepcidina-25 humana con una KD de 800 pM o menos determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR) a 25 °C y comprende seis CDR seleccionados del grupo constituido por:

(i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 52, 60, 62, 65, 71 y 75, respectivamente;

(ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 42, 76, 62, 79, 87 y 46, respectivamente;

(iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 41, 53, 31, 63, 84 y 46, respectivamente;

(iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como 10 se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 30, 31, 32, 44 y 46, respectivamente;

(v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 53, 61, 63, 85 y 46, respectivamente; y

(vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 57, 61, 63, 84 y 46, respectivamente.

Anticuerpos anti-hepcidina y usos de los mismos

La presente invención está en el campo de la medicina, en particular en el campo de anticuerpos contra hepcidina madura humana. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales selectivos de hepcidina25 que son capaces de neutralizar bioactividad de hepcidina madura humana y por lo tanto, son útiles para incrementar los niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, y/o hematocrito en un ser humano para propósitos de tratar o evitar una enfermedad, afección, o trastorno promovido por hepcidina madura humana tal como anemia.

Actualmente, las terapias adecuadas y efectivas para anemia, o para la anemia de enfermedades crónicas, son limitadas. Específicamente, la administración de eritropoyetina es efectiva en solamente aproximadamente el 50 % de todos los pacientes y está asociada con efectos secundarios no deseados. Además, las transfusiones son indeseables debido a los riesgos de contaminación, infección y sobrecarga de hierro.

La hepcidina humana, un polipéptido expresado predominantemente por los hepatocitos, se cree que es una proteína de regulación de hierro importante que regula negativamente la absorción intestinal de hierro, el reciclaje de hierro por macrófagos y la movilización de hierro a partir de reservas de hierro hepáticas. La sobreproducción de hepcidina parece jugar un papel principal en la patofisiología de anemia y/o de anemia de enfermedad crónica.

La hepcidina humana está codificada como un prepropéptido de 84 aminoácidos que contiene una secuencia señal que dirige al retículo endoplásmico de 24 aminoácidos N-terminal típica y una prorregión de 35 aminoácidos con un sitio de escisión de furina consenso seguido inmediatamente por la hormona reguladora de hierro bioactiva de 25 aminoácidos C-terminal, hepcidina-25 humana (SEC ID N.º: 1) . Diversas formas truncadas N-terminales de hepcidina-25 humana, tales como hepcidina-20 humana (es decir, 6-25 aminoácidos de SEC ID N.º: 1) y hepcidina22 humana (aminoácidos 4-25 de SEC ID N.º: 1) se sabe también que se forman in vivo.

Aunque se han comunicado anteriormente anticuerpos para hepcidina humana (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2004/0096990 y 2007/0224186 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT WO 2008/097461) , aún queda una gran necesidad en la técnica de anticuerpos adicionales para tratar enfermedades y trastornos asociados con anemia que incluyen anemia de enfermedad crónica tal como anemia de cáncer y anemia de inflamación. Dado que la hepcidina-25 es la más, si no la única, forma de hepcidina fisiológicamente relevante en seres humanos, anticuerpos que selectivamente tienen como objetivo hepcidina humana-25 comparada con polipéptidos de hepcidina que no son fisiológicamente relevantes, se necesitan particularmente. Por lo tanto, la presente invención proporciona anticuerpos terapéuticos manipulados, de alta afinidad, selectivos contra hepcidina-25 humana que tienen numerosas ventajas en el tratamiento o diagnóstico de trastornos asociados con niveles elevados de hepcidina madura tal como anemia. Por ejemplo, estos anticuerpos, que son de alta afinidad, neutralizantes, manipulados por seres humanos y altamente selectivos para formas fisiológicamente relevantes de hepcidina en seres humanos, reducirán el riesgo de efectos secundarios y la dosis clínica y la frecuencia de dosificación requerida para tratamiento efectivo. La presente invención también incluye ácidos nucleicos preferidos que codifican anticuerpos de hepcidina-25 preferidos en los que los ácidos nucleicos se han diseñado para eliminar los sitios de ayuste críptico que dan como resultado la agregación indeseada de ciertos anticuerpos de la invención tras la expresión por células huésped de mamíferos. Así, los beneficios adicionales derivados de esta la presente invención incluyen rendimiento incrementado del producto de anticuerpo de un grado de pureza deseable, recortando por lo tanto costes de producción, así como un mayor grado de efectividad clínica y seguridad para el producto de anticuerpo administrado.

Además, inmunoensayos comercialmente disponibles para hepcidina humana no diferencian las formas activas, fisiológicamente relevantes de hepcidina humana de especies de hepcidina inactivas, fisiológicamente no relevantes (véase, por ejemplo, Kemma, E.H., y cols., Haematologica, 93 (1) : 90-7 (2008) ) . Actualmente, la mayoría de los procedimientos para ensayar selectivamente para hepcidina-25 implican EM/CL (cromatografía líquida/espectroscopía de masas) o procedimientos engorrosos similares que requieren la separación de diversas formas de hepcidina (véase, por ejemplo, (Gutiérrez, J.A., y cols., BioTechniques, 38: S13-S17 (2005) , Murphy, y cols., Blood, 110: 1048-54 (2007) y Kemna, E.H., y cols., Clin. Chem. 53: 620-8 (2007) ) . Aunque estos ensayos pueden ser exactos y precisos, su complejidad, gasto y nivel alto de conocimientos especializados del operador requerido inhiben su implementación de rutina. De acuerdo con ello, hay también una gran necesidad de anticuerpos adicionales que se unan a hepcidina madura humana con alta afinidad para su aplicación en inmunoensayo relativamente simple, rápido y contundente para la detección específica o medida de las formas maduras de hepcidina humana para aplicaciones de diagnóstico y/o de pronóstico.

La presente invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a hepcidina-25 humana con una KD de 800 pM

o menos como se determina por resonancia de plasmón superficial (SPR) a 25 °C y comprende seis CDR seleccionados del grupo constituido por:

(i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se

muestran en SEC ID N.ºs: 52, 60, 62, 65, 71 y 75, respectivamente;

(ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 42, 76, 62, 79, 87 y 46, respectivamente;

(iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 41, 53, 31, 63, 84 y 46, respectivamente;

(iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 30, 31, 32, 44 y 46, respectivamente;

(v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 53, 61, 63, 85 y 46, respectivamente; y

(vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 57, 61, 63, 84 y 46, respectivamente.

En otros aspectos, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención; vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención, opcionalmente, unidos operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; células huésped que comprenden vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención; un procedimiento para producir un anticuerpo de la invención que comprende cultivar células huésped que comprenden vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención de tal modo que el ácido nucleico se expresa y opcionalmente, recuperar el anticuerpo del medio de cultivo de células huésped.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende una población homogénea o sustancialmente homogénea de un anticuerpo de la invención y un vehículo

o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos para usar en terapia. La invención también proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de aproximadamente 800 pM o menos para usar en tratar o evitar anemia en un sujeto.

La presente invención incluye el uso de un anticuerpo que se une selectivamente a hepcidina-25 humana con una KD de... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que une hepcidina-25 humana con una KD de 800 pM o menos determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR) a 25 °C y comprende seis CDR seleccionados del grupo constituido por:

(i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 52, 60, 62, 65, 71 y 75, respectivamente;

(ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 42, 76, 62, 79, 87 y 46, respectivamente;

(iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 41, 53, 31, 63, 84 y 46, respectivamente;

(iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 30, 31, 32, 44 y 46, respectivamente;

(v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 53, 61, 63, 85 y 46, respectivamente; y

(vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 43, 57, 61, 63, 84 y 46, respectivamente.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, teniendo el anticuerpo una KD para hepcidina-25 humana entre 400 pM y 30 pM determinada por SPR a 25 °C.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, teniendo el anticuerpo una KD para hepcidina-25 humana entre 200 pM y 30 pM determinada por SPR a 25 °C.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, teniendo el anticuerpo una CI50 entre 100 nM y 50 nM en un ensayo in vitro de bioactividad de hepcidina-25, midiendo dicho ensayo internalización y/o degradación de ferroportina inducida por hepcidina.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, teniendo el anticuerpo una CI50 entre 100 nM y 25 nM en un ensayo in vivo de bioactividad de hepcidina-25, midiendo dicho ensayo un decrecimiento en niveles de hierro sérico inducido por IL-6.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, siendo el anticuerpo un anticuerpo manipulado humano.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el que el marco conservado de la región variable de la cadena ligera está seleccionado entre 02, 018, o L12.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el marco conservado de la región variable de la cadena pesada está seleccionado entre VH1-69, VH1-18, o VH1-46.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) en la que (i) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 148 y 126, respectivamente; (ii) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 128 y 127, respectivamente; (iii) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 150 y 124, respectivamente; o

(iv) la HCVR y la LCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 151 y 125, respectivamente.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen (i) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 6 y 14, respectivamente; (ii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 7 y 15, respectivamente; (iii) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 9 y 17, respectivamente; o (iv) las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEC ID N.ºs: 8 y 16, respectivamente.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende dos polipéptidos de cadena pesada y dos polipéptidos de cadena ligera y en la que cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 8 y cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.º: 16.

12. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. El polinucleótido de la reivindicación 12 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N.ºs: 14, 15, 16, o

17.

14. El polinucleótido de la reivindicación 12 que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEC 5 ID N.º: 12 o 13.

15. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en terapia.

17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en el tratamiento y/o prevención de 10 anemia.

18. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para usar en incrementar niveles de hierro sérico, recuento de reticulocitos, recuento de eritrocitos, hemoglobina, o hematocrito en un sujeto.

19. Un inmunoensayo que comprende a) obtener una muestra para someterla a ensayo para hepcidina madura humana; b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones

1-11 en condiciones adecuadas para la unión de anticuerpo y dejar que cualquier hepcidina madura humana presente forme un complejo con el anticuerpo; y c) detectar la presencia o ausencia del complejo; y/o determinar la cantidad del complejo en la muestra por un procedimiento de inmunodetección.

20. El inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el procedimiento de inmunodetección es un enzimoensayo inmunosorbente (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) , un ensayo de inmunohistoquímica (IHC) , un

ensayo de inmunofluorescencia (IF) , un ensayo de aglutinación, un ensayo de transferencia de western, un ensayo de transferencia por puntos, un ensayo de transferencia en ranura o un procedimiento de detección de resistencia de plasmón superficial.

Masa (m/z)

Picos:

1. Hepcidina-25: P.M. 2.790

2. Hepcidina-24: P.M. 2.674

3. Hepcidina-22: P.M. 2.436

4. Hepcidina-20: P.M. 2.192

FIGURA 1

Masa (m/z)

Picos:

1. Hepcidina-25 (25 aa) : P.M. 2.790

2. Pro-hepcidina (60 aa) : P.M. 6.929

FIGURA 2

A. Secuencia de aminoácidos de marco conservado de cadena ligera humana O2 con residuos de CDR interdispersos

B. Secuencia de aminoácidos de un marco conservado de cadena pesada humana VH1-69 con residuos de CDR interdispersos

FIGURA 3

A. Secuencia de aminoácidos de marco conservado de cadena ligera humana O18 con residuos de CDR interdispersos

B. Secuencia de aminoácidos de un marco conservado de cadena pesada humana VH1-18 con residuos de CDR interdispersos

(SEC ID N.º: 157) (SEC ID N.º: 36)

(SEC ID N.º: 158)

(SEC ID N.º: 38)

Los residuos diferentes de los residuos de O2 están en negrita y subrayados.

A. Secuencia de aminoácidos de marco conservado de cadena ligera humana

L12 con residuos de CDR interdispersos

FIGURA 4

B. Secuencia de aminoácidos de un marco conservado de cadena pesada humana VH1-46 con residuos de CDR interdispersos

Los residuos diferentes de los residuos de O2 están en negrita y subrayados.

FIGURA 5