ANTICUERPOS ANTI-ABETA.

Un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-Aβ, que comprende las etapas de:

(a) expresar el anticuerpo en células que expresan endógenamente péptido Aβ;

(b) añadir un inhibidor de beta o de gamma secretasa al medio usado para el crecimiento de las células y

(c) purificar el anticuerpo del medio de crecimiento, teniendo el anticuerpo purificado una concentración indetectable o niveles aceptablemente bajos de péptido Aβ producido endógenamente.

Anticuerpos anti-Abeta Campo de la invención Esta invención está en el campo de la medicina. Más en particular, la invención está dirigida a un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-Aβ exento del péptido Aβ o con cantidades aceptablemente bajas del mismo.

Antecedentes de la invención Un componente principal de placas de amiloide es el péptido Aβ de los aminoácidos 39 a 43. Este péptido deriva proteolíticamente de una proteína de membrana íntegra de tipo I, la proteína precursora de amiloide (APP) . Las formas predominantes secretadas en medios de cultivo de células son péptido Aβ (1-39/40 o X-39/40) , mientras que las formas más largas, péptido Aβ (1-42/43 o X-42/43) que son menos solubles y con mayor tendencia a agregarse, constituyen las semillas nucleantes para el depósito de amiloides. Los depósitos de amiloides que comprenden péptido Aβ, (1-42/43) están asociados con afecciones y enfermedades tales como enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, angiopatía amiloide cerebral, demencias vasculares, empeoramiento cognoscitivo suave y similares.

Se han enfocado diversos tratamientos terapéuticos para afecciones y enfermedades relacionadas con depósitos anormales que contienen el péptido Aβ. en cuanto a impedir la producción de péptido y/o su agregación a plaquetas así como en cuanto a reducir o eliminar la producción de placas de amiloide. Otro enfoque de tratamiento implica la inducción de una respuesta inmunogénica al péptido Aβ por administración del péptido mediante, por ejemplo, inmunización activa (documento WO 99/27944) . Sin embargo, un reciente estudio en Fase 2A utiiizando un enfoque de inmunización con Aβ 1-42 sintético humano se suspendió tan pronto como cuatro pacientes tuvieron signos clínicos coherentes con inflamación del sistema nervioso central (SNC) . Desde la suspensión, once pacientes más presentaron inflamación asociada del SNC (Orgogozo y otros, Neurology, 61:46-54 (2003) , Schenk y otros, Curr. Opn. Immun., 16:599-606 (2004) . Así, la administración de péptido Aβ para tratar la enfermedad de Alzheimer ha causado acontecimientos adversos y generado reservas sobre su seguridad para el paciente.

Un medio inmunológico alternativo para seleccionar el péptido Aβ es por la administración de anticuerpos específicos para el péptido mediante, por ejemplo, inmunización pasiva. Si bien la inmunización pasiva no establece memoria en células T y B de la manera que lo hace la inmunización activa, el enfoque pasivo no ha generado los recelos en cuanto a la seguridad que acompañan a la inmunización activa.

El documento WO 02/46237 se refiere a anticuerpos humanizados que reconocen el péptido Aβ amiloide.

Previamente varias líneas de células, tales como K562, M17, HEK 293, CHO y HUVEC, demostraron producir péptido Aβ (Shoji y otros, Science, 258:126-129 (1002) ; Haass y otros, Nature, 359:322-325 (1992) . Consecuentemente, muchas líneas de células que se pueden usar para expresar anticuerpos humanos o humanizados para uso clínico, tales como CHO y HEK 293, contienen endógenamente holoproteína de APP así como las γ- y β-secretasas necesarias para escindir APP y por ello expresar naturalmente péptido Aβ.

Sorprendentemente, durante la preparación de anticuerpos ant-Aβ se descubrió que el péptido Aβ produce endógenamente en la mayoría de mamíferos líneas de células comúnmente usadas para expresar anticuerpos recombinantemente, se une al anticuerpo anti-Aβ a bajos niveles y se obtiene mediante el cultivo de células y procedimiento de purificación. Junto con la contaminación del péptido Aβ del material anticuerpo anti-Aβ producido recombinantemente, hay posibilidad de una respuesta inmunogénica incrementada en un paciente, siendo de una importancia clave la prevención, eliminación o reducción del péptido Aβ. Además, cuando el péptido Aβ producido endógenamente, no es humano, como con la línea de células CHO, las implicaciones de inmunogenia para el péptido Aβ no humano unido al anticuerpo anti-Aβ expresado pueden causar para la seguridad del paciente una preocupación incluso mayor y, por ello, hacer que sean vitalmente importantes la prevención, eliminación o reducción del péptido Aβ.

Sumario de la invención De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo de Aβ que comprende las etapas de:

a - expresar el anticuerpo en células que expresan endógenamente péptido Aβ, b - añadir un inhibidor beta o gamma secretasa al medio usado para crecemiento de las células, c - purificar el anticuerpo del medio de crecimiento, teniendo el que el anticuerpo purificado una concentración indetectable o niveles aceptablemente bajos de péptido Aβ producido endógenamente.

Preferiblemente, al medio se añade un inhibidor gamma secretasa. 2

Muy preferiblemente, las células son células de mamífero y son células de hamster, humanas o de ratón, seleccionadas ente CHO, HEK 293 y PER.C6.

Otra realización consiste en que el anticuerpo se exprese en células en las que la producción de Aβ se elimina mediante supresión de un gen específico, tal como el que codifica APP, β-secretasa o los genes de γ-secretasa, o mediante expresión intensificada de α-secretasa. Otra realización consiste en que el anticuerpo se produce en un cultivo de células que contiene inhibidor de αβ- o γ-secretasa.

Descripción detallada de la invención Se describen ahora los términos siguientes a los fines de la presente invención como se da a conocer y se reivindica.

Por "anticuerpo" se entiende un anticuerpo, que incluye sin limitación un anticuerpo quimérico, humanizado, humano, recombínante, transgéniico, injertado y de cadena individual, y similares, o cualesquiera proteínas de fusión, conjugadas, fragmentos o derivados de los mismos que contienen uno o varios dominios que unen selectivamente péptido Aβ. Por tanto, anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina entera, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un fragmento inmunológicamente eficaz de cualquiera de ellos. Por fragmento de anticuerpo se entiende un fragmento Fv, un Fv unido a disulfuro, scFv, Fab, Fab' o F (ab') 2, que son bien conocidos en la técnica. La expresión "anticuerpo anti-Aβ" significa un anticuerpo que reconoce o un pÃptido Aβ.

El término "anticuerpo humanizado" significa un anticuerpo que está compuesto parcial o totalmente por secuencias de aminoácidos derivadas de un línea de germen de anticuerpo humano o secuencia reordenada y formada por alteración de la secuencia de un anticuerpo que tiene regiones que determinan una complementariedad no humana (CDR) . Las regiones de marco conservado de las regiones variables son sustituidas por las correspondientes regiones de marco humanas dejando las CDR no humanas sustancialmente intactas. Las regiones de marco conservado humanas incluyen regiones de marco conservado genómicas, y también abarcan las que contienen una o varias sustituciones de aminoácido. En particular, tales sustituciones incluyen mutaciones en las que un aminoácido en una posición particular del fragmento humano es sustituido con el aminoácido de la posición correspondiente del marco conservado natural para la CDR no humana. Un anticuerpo en el contexto de anticuerpo no humanizado no está limitado a un anticuerpo de longitud entera y puede incluir fragmentos y formas de cadena individual.

El término "péptido Aβ" o "Aβ" en esta contexto incluye los péptidos 39, 40, 41, 42 y 43 de aminoácidos derivados de la proteína precursora de amiloide (APP) in vivo por proteolisis, y cualesquier fragmentos de esos péptidos, tales como péptidos acortados N-terminalmente derivados de esos péptidos (por ejemplo, los indicados por x-42, siendo x = 1, 2, 3, etc) , péptidos acortados C-terminalmente derivados de péptidos 1-39, 40, 41 y 42, y péptidos acortados en ambos extremos. Véase SEC Iaaad nº . 1, péptido Aβ humano y SEC. ID. nº . 2, péptido Aβ de roedor (esto es, ratón hamster) para detalles de cada secuencia de péptidos de aminoácidos de longitud entera.

Tal como se usa a quí, el término "β-secretasa" se refiere a una enzima implicada en el procesamiento de APP que escinde APP para generar el extremo amino del péptido Aβ. El término "γ-secretasa " se refiere al complejo... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-Aβ, que comprende las etapas de:

(a) expresar el anticuerpo en células que expresan endógenamente péptido Aβ;

(b) añadir un inhibidor de beta o de gamma secretasa al medio usado para el crecimiento de las células y 5 (c) purificar el anticuerpo del medio de crecimiento, teniendo el anticuerpo purificado una concentración indetectable

o niveles aceptablemente bajos de péptido Aβ producido endógenamente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se añade al medio un inhibidor de gamma secretasa.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las células son células de mamífero.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las células son células de hamster, humanas o de ratón.

10 5. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las células se seleccionan entre el grupo constituido por células CHO, HEK 293 y PER C6.