Un anticuerpo anti-CD52 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera,

en el que dicha cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 7; y dicha cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11 y SEC ID Nº: 12.

Anticuerpo anti-CD52 modificado Campo de la invención La presente invención se refiere a polipéptidos para administrar, especialmente a seres humanos y en particular para uso terapéutico. Los polipéptidos son polipéptidos modificados, de manera que la modificación dé como resultado un número reducido de epítopos de linfocitos T potenciales que proporciona una propensión reducida a que el polipéptido induzca una respuesta inmune tras administración a un sujeto humano. La invención en particular se refiere a la modificación de anticuerpos reactivos al antígeno de leucocitos humanos CD52 para proporcionar anticuerpos anti-CD52 que tengan un número reducido de epítopos de linfocitos T potenciales, pero conserven la capacidad para unirse a CD52.

Antecedentes de la invención

Existen muchos casos por los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmune no deseada a la proteína terapéutica. Se ha mostrado que varios anticuerpos monoclonales de ratón son prometedores como terapias en varias situaciones de enfermedad humana pero en ciertos casos han fracasado debido a la inducción de grados significativos de una respuesta de anticuerpo humano antimurino (HAMA) [Schroff y col. (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler y col. (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. Para anticuerpos monoclonales, se han desarrollado varias técnicas en un intento de reducir la respuesta HAMA [documentos WOA8909622; EPA0239400; EPA0438310; WOA9106667; EPA0699755]. Estos enfoques de ADN recombinante han reducido en general la información genética de ratón en la construcción de anticuerpo final aumentando a la vez la información genética humana en la construcción final. No obstante, los anticuerpos "humanizados" resultantes han inducido aún, en varios casos, una respuesta inmune en pacientes [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello y col. (1999) Transplantation 68: 1417-1420].

Los anticuerpos no son la única clase de molécula polipeptídica administrada como un agente terapéutico contra la que puede montarse una respuesta inmune. Incluso proteínas de origen humano y con las mismas secuencias de aminoácidos que aparecen dentro de los seres humanos pueden inducir aún una respuesta inmune en seres humanos. Los ejemplos notables incluyen uso terapéutico de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos [Wadhwa y col., (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] e interferón a2 [Russo y col. (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein y col. (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413] entre otros.

Es clave para la inducción de una respuesta inmune la presencia dentro de la proteína de péptidos que puedan estimular la actividad de linfocitos B mediante presentación en moléculas de MHC de clase II, denominadas "epítopos de linfocitos T". Tales epítopos de linfocitos T se definen habitualmente como cualquier secuencia de restos de aminoácidos con la capacidad para unirse a moléculas del MHC de clase II. De forma implícita, un "epítopo de linfocitos T" significa un epítopo que cuando se une a moléculas de MHC puede reconocerse por un receptor de linfocitos T (TCR) y que puede, al menos en principio, provocar la activación de estos linfocitos T interaccionando con un TCR para promover una respuesta de linfocitos T.

Las moléculas de MHC de Clase II son un grupo de proteínas altamente polimórficas que desempeñan un papel central en la selección y activación de linfocitos T auxiliares. El grupo de antígenos de leucocitos humanos DR (HLA-DR) son el isotipo predominante de este grupo de proteínas, sin embargo los isotipos HLA-DQ y HLA-DP desempeñan funciones similares. En la población humana, los individuos portan de dos a cuatro alelos de DR, dos alelos DQ y dos DP. La estructura de varias moléculas DR se ha resuelto y estas aparecen como un surco de unión de péptido de extremos abiertos con varios bolsillos hidrófobos que interaccionan con los restos hidrófobos (restos de bolsillo) del péptido [Brown y col., Nature (1993) 364: 33; Stern y col. (1994) Nature 368: 215]. El polimorfismo que identifica los diferentes alotipos de la molécula de clase II contribuye a una amplia diversidad de diferentes superficies de unión para péptidos dentro del surco de unión de péptidos y al nivel de población asegura flexibilidad 45 máxima con respecto a la capacidad para reconocer proteínas ajenas y montar una respuesta inmune a organismos patógenos.

Una respuesta inmune a una proteína terapéutica transcurre mediante la ruta de presentación de péptidos de MHC de clase II. Aquí las proteínas exógenas se incluyen y procesan para presentación en asociación con moléculas de MHC de clase II del tipo DR, DQ o DP. Las moléculas de MHC de Clase II se expresan por células de presentación de antígenos profesionales (APC) , tales como macrófagos y células dendríticas entre otras. La interacción de un complejo de péptidos de MHC de clase II con un receptor de linfocitos T afín en la superficie del linfocito T, junto con la unión cruzada de ciertos otros correceptores tales como la molécula CD4, puede inducir un estado activado dentro del linfocito T. La activación conduce a la liberación de citocinas activando adicionalmente otros linfocitos tales como linfocitos B para producir anticuerpos o activando linfocitos citolíticos T como una respuesta inmune celular 55 completa.

La identificación de epítopos de linfocito T es la primera etapa para eliminación de epítopos como se reconoce en el documento WO98/52976 y WO00/34317. En estas enseñanzas, se retiran epítopos de linfocitos T predichos mediante el uso de sustituciones de aminoácidos sensatas dentro de la proteína de interés. Además de técnicas

computacionales, existen procedimientos in vitro para medir la capacidad de péptidos sintéticos para unirse a moléculas de MHC de clase II. Un procedimiento ejemplar utiliza líneas de linfocitos B de alotipo MHC definido como una fuente de superficie de unión a MHC de clase II y puede aplicarse a identificación de ligando de MHC de clase II [Marshall y col. (1994) J. Immunol. 152: 4946-4956; O'Sullivan y col. (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey y col. (1997) J. Immunol 159: 3238-3246]. Sin embargo, tales técnicas no están adaptadas para la exploración de múltiples epítopos potenciales para una amplia diversidad de alotipos de MHC, ni pueden confirmar la capacidad de un péptido de unión para actuar como un epítopo de linfocitos T.

Recientemente, se ha empezado a usar técnicas que explotan complejos solubles de molécula de MHC recombinantes en combinación con péptidos sintéticos [Kern y col. (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok y col. (2001) TRENDS in Immunol. 22: 583-588]. Estos reactivos y procedimientos se usan para identificar la presencia de clones de linfocitos T de muestras de sangre periférica de sujetos animales experimentales o humanos que son capaces de unirse a complejos de péptidos de MHC particulares y no están adaptados para la exploración de múltiples epítopos potenciales para una amplia diversidad de alotipos de MHC.

Como se ha representado anteriormente y como consecuencia de lo mismo, sería deseable identificar y retirar o al menos reducir epítopos de linfocitos T potenciales de un péptido, polipéptido o proteína dados en principio terapéuticamente valiosos pero originalmente inmunogénicos. Una de estas moléculas terapéuticamente valiosas es un anticuerpo monoclonal con especificidad de unión por el antígeno de leucocitos humanos CD52. El anticuerpo monoclonal preferido de la presente invención es una forma modificada del anticuerpo de rata denominado "CAMPATH". Es un objetivo de la invención proporcionar formas modificadas del anticuerpo CAMPATH con uno o más epítopos de linfocitos T potenciales retirados.

La molécula CD52 tiene un peso molecular de 21-28 kDa, y la proteína madura comprende un péptido de 12 aminoácidos uniéndose un oligosacáridos ligado a N a la membrana por su anclaje de glucofosfatidilinositol. El antígeno está presente en al menos 95 % de los linfocitos de sangre periférica humana y también células de la serie de monocitos/macrófagos y además espermatozoides. No está presente en eritrocitos, plaquetas, células dendríticas tisulares o células madre de médula ósea (Hale y col. (1990) Tissue Antigens 35: 873; Buggins y col. (2002) Blood, 100: 1715) .

Los primeros anticuerpos CD52 se indujeron en una rata inmunizada con linfocitos humanos en un intento de obtener anticuerpos que activaran el complemento para su uso para agotar la médula donadora de linfocitos T antes del trasplante [Hale y col. (1983)... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-CD52 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 7; y dicha cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11 y SEC ID Nº: 12.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena pesada comprende adicionalmente un dominio de región constante de IgG1 humano y dicha cadena ligera comprende adicionalmente un dominio de región constante kappa humano.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha cadena pesada comprende SEC ID Nº: 4 y dicha cadena ligera comprende SEC ID Nº: 12.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha cadena pesada comprende SEC ID Nº: 7 y dicha cadena ligera comprende SEC ID Nº: 12, o dicha cadena pesada comprende SEC ID Nº: 7 y dicha cadena ligera comprende SEC ID Nº: 10, o dicha cadena pesada comprende SEC ID Nº: 3 y dicha cadena ligera comprende SEC ID Nº: 10 o dicha cadena pesada comprende SEC ID Nº: 6 y dicha cadena ligera comprende SEC ID Nº: 10.

5. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la preparación de un producto farmacéutico para tratar tumores malignos linfoides, para tratar afecciones autoinmunes o para inmunosuprimir a un paciente antes de

o después de trasplante de un órgano.

7. Uso de la reivindicación 6, en el que dicho tumor maligno linfoide es leucemia o linfoma, en el que dicha afección autoinmune es esclerosis múltiple, artritis reumatoide, vasculitis sistémica, uveítis, enfermedad inflamatoria del intestino o esclerodermia, y en el que dicho trasplante de un órgano es un trasplante renal.

8. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de región V como se define en la reivindicación 1, ligado operativamente con una secuencia de control de la expresión.

9. El vector de expresión de la reivindicación 8, en el que dicha secuencia que codifica la cadena pesada de región V es SEC ID Nº: 72.

10. El vector de expresión de la reivindicación 8, comprendiendo el vector adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de región constante de IgG1 humano.

11. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de región V como se define en la reivindicación 1, ligado operativamente con una secuencia de control de la expresión.

12. El vector de expresión de la reivindicación 11, en el que dicha secuencia que codifica la cadena ligera de región V es SEC ID Nº: 80.

13. El vector de expresión de la reivindicación 11, comprendiendo el vector adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de región constante kappa humano.

14. Una célula cultivada que comprende los vectores de las reivindicaciones 8 y 11, o que se transfecta con los vectores de las reivindicaciones 8 y 11.

15. Un procedimiento para preparar una inmunoglobulina, comprendiendo el procedimiento las etapas de (i) cultivar la célula transfectada por duplicado de la reivindicación 14 y (ii) purificar la inmunoglobulina del medio de dicha célula.