Amplificación de secuencias repetitivas de ácido nucleico.

Método para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva de un ácido nucleico diana humano que comprende:

a) poner en contacto un ácido nucleico diana que comprende primera y segunda cadenas sustancialmente complementarias con un primer y segundo cebador, en el que dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena y dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dichos cebadores hibridados son capaces de la extensión de cebador cuando hibridan con sus cadenas respectivas, y en el que al menos un nucleótido de dicho primer cebador produce un emparejamiento erróneo de pares de bases entre dicho primer cebador y un nucleótido en dicha unidad repetitiva cuando dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena, en el que dicho primer cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho segundo cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí, en el que al menos un nucleótido en dicho segundo cebador produce un emparejamiento erróneo de pares de bases entre dicho segundo cebador y un nucleótido de dicha unidad repetitiva cuando dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dicho segundo cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho primer cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí; y

b) amplificar el ácido nucleico diana por la reacción en cadena de la polimerasa.

Amplificación de secuencias repetitivas de ácido nucleico.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de la tecnología de ADN recombinante. Específicamente, la presente invención está dirigida a composiciones y métodos para amplificar ácidos nucleicos diana, especialmente amplificación directa de secuencias repetitivas de ácido nucleico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La detección de la presencia de ácidos nucleicos diana es vital en numerosas aplicaciones en el diagnóstico médico, medicina forense, análisis genético y salud pública. Por ejemplo, la identificación de secuencias de ADN específicas es crítica para el diagnóstico de trastornos hereditarios, la determinación de la susceptibilidad a enfermedades y la identificación de agentes causales de enfermedades infecciosas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) proporciona un método altamente sensible para detectar la presencia de ácidos nucleicos diana por la amplificación selectiva de ácidos nucleicos diana. El método se basa en el uso de cebadores oligonucleotídicos que hibridan con extremos opuestos de un segmento de ácido nucleico diana, un amplicón y la copia cebada del segmento del ácido nucleico por una polimerasa. Los ciclos reiterativos de síntesis de ADN, desnaturalización y rehibridación permiten la amplificación exponencial de un ácido nucleico diana dado.

La selección de los cebadores es un determinante principal en el éxito o fracaso de la reacción de amplificación. Los factores críticos incluyen la longitud del cebador, temperatura de fusión (Tm) , especificidad de secuencia, secuencias complementarias del cebador, contenido G/C y secuencia de la región 3'-terminal. En general, los cebadores deben hibridar con especificidad con el ácido nucleico diana pero no deben hibridar con ni amplificar secuencias de ácido nucleico no diana.

La amplificación de ácidos nucleicos no diana se vuelve problemática cuando el extremo 3' de un cebador es complementario con otro cebador. Estos cebadores tenderán a hibridar entre sí, que entonces se extienden por la polimerasa para formar productos "dímero de cebador". La amplificación posterior de dímeros de cebador da lugar a la depleción de cebadores, lo que resulta en una sensibilidad reducida o incluso fracaso de la amplificación del ácido nucleico diana pretendido. La realización de las extensiones de cebador o hibridación preamplificación a temperaturas que limitan los híbridos cebador-cebador (por ejemplo, PCR de "arranque en caliente", D'Aquila, R.T. et al., Nucleic Acids Res. 19: 3749 (1991) , PCR "touchdown", Don, R.H. et al., Nucleic Acids Res. 19: 4008 (1991) ) o el ajuste de los componentes tamponadores para incrementar la astringencia de la hibridación puede minimizar la interferencia de los dímeros de cebador. Sin embargo, la presencia de cebadores en exceso durante las reacciones de PCR permite que incluso una débil complementariedad en la región 3' terminal genere estos productos secundarios de interferencia.

Aunque la elección de diferentes regiones del ácido nucleico diana para seleccionar cebadores proporciona una base para limitar las amplificaciones no dependientes de ácidos nucleicos diana, las restricciones en la selección de secuencias para generar cebadores pueden limitar la elección de diseños de cebador alternativos. Por ejemplo, la amplificación directa de secuencias cortas repetitivas en tándem tales como repeticiones de telómero es difícil porque los cebadores para estas secuencias siempre tendrán algún grado de complementariedad. Estas secuencias repetitivas no permiten normalmente una elección de secuencias de cebador para limitar la formación de productos dímeros de cebador. Consecuentemente, los métodos actuales para estimar las longitudes de telómero se basa en la digestión con enzimas de restricción del ADN genómico seguido de la hibridación con secuencias repetitivas (análisis de fragmento de restricción terminal; véase Harley, C.B. et al., Nature 345: 458-460 (1990) ) , amplificación indirecta de repeticiones usando secuencias únicas situadas fuera de la región de repetición (Véase Kozlowski, M.R. et al., Patente EEUU No. 5.741.677) , hibridación in situ con fluorescencia (véase Henderson, S.J. Cell Biol. 134: 1-12 (1996) ) o métodos de citometría de flujo (véase Hultdin, M. Nucleic Acids Res. 26: 3651-3656 (1998) ) . Generalmente, estos procedimientos son largos o requieren cantidades sustanciales de ADN. Como el número de copias de las repeticiones teloméricas y otras secuencias repetitivas en tándem en una célula se correlaciona con los estados fisiológicos o patológicos de una célula, existe una necesidad de composiciones y métodos para amplificar y cuantificar rápidamente estas secuencias a la vez que se evitan generalmente las reacciones secundarias de dímeros de cebador competitivos durante la amplificación.

Tatematsu et al (Oncogene (1996) 13: 2265-2274) y JP 9206081 describen un método nuevo basado en PCR para medir la actividad telomerasa y muestran que este método es útil para el análisis cuantitativo de la telomerasa humana. Los complejos cebador/cebador formados entre los cebadores de PCR directos e inversos usados en este método tenían un emparejamiento erróneo de un par de bases en los extremos 3', evitando de esta manera la producción de productos de PCR derivados de este complejo. Además, se introdujeron secuencias "etiqueta" extra no relacionadas en los extremos

5' de los cebadores de PCR. El molde de partida en estas dos descripciones es un ADN monocatenario formado por una telomerasa y el primer cebador.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Según los objetos resaltados anteriormente, la presente invención proporciona métodos para amplificar ácidos nucleicos diana a la vez que se limitan las amplificaciones no dependientes de ácido nucleico diana. Una realización preferida, proporciona un método para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva de un ácido nucleico diana humano que comprende:

a) poner en contacto un ácido nucleico diana que comprende primera y segunda cadenas sustancialmente complementarias con un primer y un segundo cebador, en el que dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena y dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dichos cebadores hibridados son capaces de extensión de cebador cuando hibridan con sus cadenas respectivas, y en el que al menos un nucleótido de dicho primer cebador produce un emparejamiento erróneo de un par de bases entre dicho primer cebador y un nucleótido en dicha unidad repetitiva cuando dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena, en el que dicho primer cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho segundo cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí, en el que al menos un nucleótido en dicho segundo cebador produce un emparejamiento erróneo de un par de bases entre dicho segundo cebador y un nucleótido de dicha unidad repetitiva cuando dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dicho segundo cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho primer cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí; y b) amplificar el ácido nucleico diana por la reacción en cadena de la polimerasa.

En una realización preferida para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva, el primer cebador hibrida con más de una unidad repetitiva de la primera cadena y el segundo cebador hibrida con más de una unidad repetitiva de la segunda cadena del ácido nucleico diana. Los residuos de nucleótidos del primer y segundo cebadore se alteran para producir emparejamientos erróneos entre los residuos alterados y los residuos de nucleótidos en la posición de nucleótidos idéntica de cada unidad repetitiva de la primera y segunda cadena respectivamente.

En una realización preferida, la presente invención proporciona métodos para determinar el número de unidades repetitivas en una región repetitiva de un ácido nucleico diana, tales como telómeros, midiendo la cantidad de ácidos nucleicos diana amplificados. Estos métodos encuentran aplicaciones en el diagnóstico del cáncer y la evaluación de la senescencia celular.

Según los métodos descritos, la presente invención proporciona además composiciones para, y el uso de éstas en, métodos para amplificar... [Seguir leyendo]

1. Método para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva de un ácido nucleico diana humano que comprende:

a) poner en contacto un ácido nucleico diana que comprende primera y segunda cadenas sustancialmente complementarias con un primer y segundo cebador, en el que dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena y dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dichos cebadores hibridados son capaces de la extensión de cebador cuando hibridan con sus cadenas respectivas, y en el que al menos un nucleótido de dicho primer cebador produce un emparejamiento erróneo de pares de bases entre dicho primer cebador y un nucleótido en dicha unidad repetitiva cuando dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena, en el que dicho primer cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho segundo cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí, en el que al menos un nucleótido en dicho segundo cebador produce un emparejamiento erróneo de pares de bases entre dicho segundo cebador y un nucleótido de dicha unidad repetitiva cuando dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dicho segundo cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho primer cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí; y b) amplificar el ácido nucleico diana por la reacción en cadena de la polimerasa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho primer y segundo cebadores comprenden además secuencias 5' terminales que no hibridan con dichas unidades repetitivas.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dichos emparejamientos erróneos están en posiciones de nucleótidos adyacentes de dicha unidad repetitiva.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dichos emparejamientos erróneos están en posiciones de nucleótidos no adyacentes de dicha unidad repetitiva.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha unidad repetitiva comprende repeticiones de hexanucleótidos.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha unidad repetitiva comprende repeticiones de pentanucleótidos.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicha unidad repetitiva comprende repeticiones de tetranucleótidos.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dicha unidad repetitiva comprende unidades teloméricas repetitivas.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho primer cebador comprende la SEQ ID NO: 1 y dicho segundo cebador comprende la SEQ ID NO: 2.

10. Método según la reivindicación 8, en el que dicho primer cebador comprende la SEQ ID NO: 8 y dicho segundo cebador comprende la SEQ ID NO: 9.

11. Método para determinar el número de unidades repetitivas en una región repetitiva de un ácido nucleico diana según la reivindicación 1 que comprende además medir la cantidad de producto amplificado (T) .

12. Método según la reivindicación 11 en el que dicha medición es por PCR cuantitativa en tiempo real.

13. Método según la reivindicación 11, que comprende además

a) amplificar un ácido nucleico diana con un número de copias conocido (S) ; y b) determinar la proporción T/S para determinar el número de copias de la unidad repetitiva.

14. Método según la reivindicación 13 para diagnosticar cáncer.

15. Método según la reivindicación 13 para diagnosticar senescencia celular.

16. Uso de una composición para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva de un ácido nucleico diana humano que comprende primera y segunda cadenas diana sustancialmente complementarias, comprendiendo dicha composición un primer y segundo cebador, en el que dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena y dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dichos cebadores hibridados son capaces de la extensión de cebador cuando hibridan con sus cadenas respectivas, y en el que al menos un nucleótido de dicho primer cebador produce un emparejamiento erróneo de pares

de bases entre dicho primer cebador y un nucleótido en dicha unidad repetitiva cuando dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena, en el que dicho primer cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho segundo cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí, en el que al menos un nucleótido de dicho segundo cebador produce un emparejamiento erróneo de pares de bases entre dicho segundo cebador y un nucleótido de dicha unidad repetitiva cuando dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dicho segundo cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho primer cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí.

17. Composición para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva de un ácido nucleico diana humano que comprende primera y segunda cadenas diana sustancialmente complementarias, comprendiendo dicha composición un primer y segundo cebador, en el que dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena y dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dichos cebadores hibridados son capaces de la extensión de cebador cuando hibridan con sus cadenas respectivas, y en el que al menos un nucleótido de dicho primer cebador produce un emparejamiento erróneo de pares de bases entre dicho primer cebador y un nucleótido en dicha unidad repetitiva cuando dicho primer cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha primera cadena, en el que dicho primer cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho segundo cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí, en el que al menos un nucleótido de dicho segundo cebador produce un emparejamiento erróneo de pares de bases entre dicho segundo cebador y un nucleótido de dicha unidad repetitiva cuando dicho segundo cebador hibrida con al menos una unidad repetitiva de dicha segunda cadena, en el que dicho segundo cebador también produce un emparejamiento erróneo con el nucleótido 3' terminal de dicho primer cebador cuando el primer y segundo cebadores hibridan entre sí.

18. Uso según la reivindicación 16 o una composición según la reivindicación 17, en el que dicho primer y segundo cebadores comprenden además secuencias 5' terminales que no hibridan con dichas unidades repetitivas.

19. Uso o composición para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva según la reivindicación 18, en el que 25 dichas unidades repetitivas comprenden unidades teloméricas repetitivas.

20. Uso o composición para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva según la reivindicación 19, en el que dicho primer cebador comprende la SEQ ID NO: 1 y dicho segundo cebador comprende la SEQ ID NO: 2.

21. Uso o composición para amplificar unidades repetitivas en una región repetitiva según la reivindicación 19, en el que dicho primer cebador comprende la SEQ ID NO: 8 y dicho segundo cebador comprende la SEQ ID NO: 9.