Agentes antimicrobianos.

Una variante de endolisina que comprende una endolisina a la que se fusiona un tramo peptídico catiónico conactividad desestabilizante de LPS,

en el que dicho tramo peptídico catiónico comprende de 5 a 100 restos deaminoácidos y en el que al menos el 70 % de los restos de aminoácidos comprendidos en dicho tramo peptídico sonarginina y/o lisina y del 0 % al 30 % son serina y/o glicina

Agentes antimicrobianos La presente invención se refiere a variantes de endolisina modificadas con acción antibacteriana mejorada contra bacterias Gram negativas. Dichas variantes de endolisina modificadas comprenden una endolisina y un péptido catiónico fusionado a la endolisina, potenciado así la cationicidad de dicha endolisina. La presente invención también se refiere a un microorganismo transformado con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de endolisina modificada con cationicidad potenciada. La invención también se refiere a un procedimiento para la producción de una variante de endolisina usando, como organismo de producción, un microorganismo transformado con un ácido nucleico que codifica una variante de endolisina de acuerdo con la presente invención.

En particular la presente invención se refiere a variantes de endolisina que comprenden una endolisina a la cual se fusiona un tramo peptídico catiónico con actividad desestabilizadora de LPS, comprendiendo dicho tramo peptídico catiónico de 5 a 100 restos de aminoácidos y siendo al menos el 70 % de los restos de aminoácidos, comprendidos en dicho tramo peptídico, arginina y/o lisina y siendo del 0 % al 30 % serina y/o glicina. Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican dicha variante de endolisina modificada, a vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico y a células huésped que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico o dichos vectores. Adicionalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir dicha variante de endolisina. Por otro lado, la presente invención se refiere a dicha variante de endolisina modificada para su uso como un medicamento, en particular para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas Gram negativas, como medio de diagnóstico, desinfectante o como sustancia cosmética. La presente invención también se refiere a la eliminación, reducción o prevención de contaminación de bacterias Gram negativas de productos alimenticios, de equipos de tratamiento de alimentos, de instalaciones de tratamiento de alimentos, de superficies que se ponen en contacto con productos alimenticios, de dispositivos médicos, de superficies en hospitales y salas quirúrgicas. Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de dicha variante de endolisina como un medio de diagnóstico en el diagnóstico médico, alimentario o alimentario para animales o ambiental.

Las endolisinas son peptidoglicano hidrolasas codificadas por bacteriófagos (o virus bacterianos) . Se sintetizan durante la expresión génica tardía en el ciclo lítico de multiplicación de fagos y median la liberación de los viriones progenie de las células infectadas a través de la degradación del péptidoglicano bacteriano. Son β (1, 4) -glicolisasas (lisozimas) , transglicosilasas, amidasas o endopeptidasas. La aplicación antimicrobiana de las endolisinas ya la sugirió por Gasson (documento GB224361 1) en 1991. Aunque la capacidad destructora de las endolisinas se conoce desde hace tiempo, el uso de estas enzimas como agentes antibacterianos se ignoraba debido al éxito y predominio de los antibióticos. Únicamente después de la aparición de bacterias resistentes a antibióticos múltiples este sencillo concepto de combatir patógenos humanos con endolisinas recibió interés. Surgió una necesidad apremiante de desarrollar clases de agentes antibacterianos totalmente nuevas y las endolisinas usadas como ‘enzibióticos’ - un término híbrido de ‘enzimas’ y ‘antibióticos’ - cumplió perfectamente esta necesidad. En el año 2001, Fischetti y colaboradores demostraron por primera vez el potencial terapéutico de las endolisinas del bacteriófago C1 contra estreptococos del grupo A (Nelson y col., 2001) . Desde entonces muchas publicaciones han admitido a las endolisinas como una alternativa atractiva y complementaria para el control de infecciones bacterianas, particularmente ocasionadas por bacterias Gram positivas. Posteriormente, diferentes endolisinas contra otros patógenos Gram positivos, tales como Streptococcus pneumoniae (Loeffler y col., 2001) , Bacillus anthracis (Schuch y col., 2002) , S. agalactiae (Cheng y col., 2005) y Staphylococcus aureus (Rashel y col, 2007) han demostrado su eficacia como enziantibióticos. Actualmente, el reto más importante de la terapia con endolisinas reside en la insensibilidad de las bacterias Gram negativas hacia la acción exógena de las endolisinas, ya que la membrana externa del peptidoglicano blinda el acceso de las endolisinas. Esto normalmente impide la expansión de una serie de endolisinas eficaces contra importantes patógenos Gram negativos.

Las bacterias Gram negativas poseen una membrana externa, con su típica bicapa asimétrica característica. La bicapa de la membrana externa consiste en una monocapa interna que contiene fosfolípidos (principalmente fosfatidil etanolamina) y una monocapa externa principalmente compuesta por un solo glicolípido, lipopolisacárido (LPS) . En el reino bacteriano existe una inmensa diversidad de estructuras LPS y la estructura LPS puede modificarse en respuesta a las condiciones ambientales reinantes. La estabilidad de la capa LPS y la interacción entre diferentes moléculas LPS se consigue principalmente por la interacción electrostática de iones divalentes (Mg2+, Ca2+) con los componentes aniónicos de la molécula LPS (grupos fosfato en el lípido A y el núcleo interno y grupos carboxilo de KDO) . Por lo tanto, los sitios de unión a cationes son esenciales para la integridad de la membrana externa (Vaara, 1992) . Agentes policatiónicos tales como polímeros de poli-L-lisina (de al menos 20 restos) aumentan la permeabilidad de la membrana externa por desplazamiento de estos cationes divalentes estabilizantes. Además, ejercen un mecanismo denominado ‘captación autopromovida’ (Hancock y Wong, 1984) . Debido a su voluminosidad, desestabilizan la función de barrera normal de la membrana externa y crean grietas transitorias, promoviendo su propia captación (Vaara y Vaara, 1983) . Adicionalmente, la densa y ordenada compactación del resto hidrófobo del lípido A, favorecido por la ausencia de ácidos grasos insaturados, forma una estructura rígida con alta viscosidad. Esto le hace menos permeable a moléculas lipófilas y confiere estabilidad adicional a la membrana externa (ME) .

Sin embargo, la progresiva resistencia microbiana a los antibióticos, está creando cada vez más dificultades en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias. En concreto surgen dificultades particulares con infecciones causadas por bacterias Gram negativas de tipo Pseudomonas aeruginosa y Enterobacteriáceas.

Por tanto, existe una necesidad de nuevos agentes antimicrobianos contra bacterias Gram negativas.

Este propósito lo resuelve la materia objeto definida en las reivindicaciones.

Las siguientes figuras ilustran la presente invención.

La Figura 1 es una visión global esquemática que muestra una construcción plasmídica para la producción recombinante de (POLY) n-gp144 ( (POLY) n-KZ144) . Previamente, se construyó pEXP5CT/POLY-gp144 (pEXPSCT/POLYKZ144) mediante una tail PCR (con el sitio de restricción BamHI y un primer casete policatiónico en el cebador tail 5’) . El plásmido se linealizó con BamHI, se desfoforiló y se ligó con un casete que contenía extremos BamHI salientes. Este casete se origina a partir de la hibridación de dos oligonucleótidos complementarios y codifica 9 restos cargados positivamente. Entre el primer y el segundo casete se crea un resto de arginina positivo adicional, junto con una serina. De manera similar se construyeron variantes más largas pEXP5CT/ (POLY) n-gp144 (pEXP5CT/ (POLY) n-KZ144) mediante ciclos repetidos.

La Figura 2 muestra la expresión y secreción de POLY-gp144 por Pichia pastoris. Se añade una cantidad de 30 μl de sobrenadante de un cultivo de expresión de X33 de P. pastoris [después de 1 día (cuadrados) , 3 días (triángulos) y 4 días (círculos) ] a 270 μl de células PAOlp de P. aeruginosa permeabilizadas con cloroformo. Las condiciones del tampón eran las condiciones enzimáticas óptimas de POLY-gp144 (KH2PO4/K2HPO4) I = 120 mM, pH 6, 2) . Posteriormente, se registró la densidad óptica espectrofotométricamente. Una disminución en la densidad óptica indica la secreción de una enzima muralítica por P. pastoris. Como control negativo, se incluyó la cepa X33 de P. pastoris sin plásmido de expresión (rombo) .

La Figura 3 muestra, en una representación gráfica, la actividad antibacteriana de las endolisinas phiKZgp144 y ELgp188 no modificadas, de las variantes POLY-gp144 y POLY-gp188 modificadas,... [Seguir leyendo]

1. Una variante de endolisina que comprende una endolisina a la que se fusiona un tramo peptídico catiónico con actividad desestabilizante de LPS, en el que dicho tramo peptídico catiónico comprende de 5 a 100 restos de aminoácidos y en el que al menos el 70 % de los restos de aminoácidos comprendidos en dicho tramo peptídico son arginina y/o lisina y del 0 % al 30 % son serina y/o glicina.

2. La variante de endolisina de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho tramo peptídico comprende de 5 a 50 restos de aminoácidos, en particular de 5 a 30 restos de aminoácidos.

3. La variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho tramo peptídico está fusionado en el extremo N y/o C de la endolisina, en particular en el extremo N de la endolisina.

4. La variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha endolisina posee actividad de degradación de la pared celular de las bacterias Gram-negativas, en particular la pared celular de las bacterias Gram-negativas seleccionadas del grupo que consiste en

Enterobacteriaceae, en particular Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter; Edwardsiella. Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganeella, Proteus, Providencia, Serratia, y Yersinia; Pseudomonadaceae, en particular Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewallella, Sphingomonas y Comamonas, Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella; Bartonella, Coxiella. Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae; en particular Treponema y Borrelia, Leptospiraceae, Campylobacter; Helicobacter, Spirilum, Streptobacillus, Bacteroidaceae, en particular Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella y Porphyromonas y Acinetobacter, en particular A. baumanii.

5. La variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha endolisina se selecciona del grupo que consiste en phiKZgp144 de acuerdo con la SEC ID Nº: 1, ELgp 188 de acuerdo con la SEC ID Nº: 2, la endolisina de Salmonella de acuerdo con la SEC ID Nº: 3, la endolisina del fago T4 de Enterobacterias de acuerdo con la SEC ID Nº: 4, la endolisina de Acinetobacter baumanii de acuerdo con la SEC ID Nº: 5, la endolisina del fago K1F de E. coli de acuerdo con la SEC ID Nº: 6, la endolisina de PSP3 de Salmonella de acuerdo con la SEC ID Nº: 8 y la endolisina del fago P2 de E. coli de acuerdo con la SEC ID Nº: 9.

6. La variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho tramo peptídico comprende al menos un motivo KRK, en particular en el que dicho tramo peptídico consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 10 a 30.

7. La variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha variante de endolisina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 35 a 49, 53, 57, 62 a 64 y 66 a 78.

8. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico, de acuerdo con la reivindicación 8, o un vector de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha célula huésped es, en particular, una célula bacteriana o una célula de levadura.

11. Un procedimiento para la producción de una variante de endolisina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la expresión de la variante de endolisina en una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10.

12. La variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como un medicamento.

13. La variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso como un medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas Gram-negativas.

14. El uso de la variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como medio de diagnóstico, desinfectante o sustancia cosmética.

15. El uso de la variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la eliminación, reducción y/o prevención de contaminación bacteriana Gram-negativa de productos alimenticios, de equipos de tratamiento de alimentos; de instalaciones de tratamiento de alimentos, de superficies que se ponen en contacto con productos alimenticios, de dispositivos médicos o de superficies en hospitales y salas quirúrgicas.

16. El uso de la variante de endolisina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como medio de diagnóstico para un diagnóstico médico, alimentario o alimentario para animales o ambiental.

17. La variante de endolisina para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13 o el uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha variante de endolisina se usa en combinación con antibióticos, lantibióticos o bacteriocinas.