ADENOVIRUS RECOMBINANTES QUE COMPRENDEN PROTEÍNAS DE ADENOVIRUS DE SIMIOS Y USOS DE LOS MISMOS.

Un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus,

caracterizado porque el cápside comprende una proteína hexon compuesta por uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID núm. 16, fusionada en un péptido hexon de adenovirus heterólogo, encapsidando dicho cápside una molécula para su suministro a una célula objetivo, en el que la molécula comprende una secuencia de repetición de terminal invertido 5' (ITRs) de adenovirus, un minigén, y una ITR 3' de adenovirus, en el que dicho uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 se selecciona en el grupo consistente en:

(a) aminoácidos 131 a 441 de SEQ ID núm. 16;

(b) aminoácidos 138 a 163 de SEQ ID núm. 16;

(c) aminoácidos 169 a 176 de SEQ ID núm. 16;

(d) aminoácidos 195 a 203 de SEQ ID núm. 16;

(e) aminoácidos 233 a 246 de SEQ ID núm. 16;

(f) aminoácidos 253 a 264 de SEQ ID núm. 16;

(g) aminoácidos 287 a 297 de SEQ ID núm. 16, y

(h) aminoácidos 404 a 430 de SEQ ID núm. 16.

Adenovirus recombinantes que comprenden proteínas de adenovirus de simios y usos de los mismos Antecedentes de la invención Los adenovirus recombinantes han sido descritos para usos de terapias de gen y vacunas.

Los adenovirus tienen una morfología característica con un cápside icosaédrico consistente en tres proteínas mayores, hexon (II) , penton base (III) y fibra en forma de botón (IV) , junto con un número de otras tres proteínas menores, VI, VIII, IX, IIIa y IVa2 [W.C. Russell, J. Gen Virol., 81:2573-2604 (Noviembre 2000) ]. El genoma de virus es un ADN lineal, de doble cadena, con una proteína terminal unida covalentemente a las terminaciones 5', la cuales tienen repeticiones terminales invertidas (ITRs) . El ADN de virus está íntimamente asociado a la proteína altamente básica VII y a un pequeño péptido denominado mu. Otra proteína, V, está empaquetada con este complejo de ADNproteína y proporciona un enlace estructural para el cápside a través de la proteína VI. El virus contiene también una proteasa codificada con virus, la cual es necesaria para el procesamiento de algunas de las proteínas estructurales para producir virus infecciosos maduros.

Sigue existiendo una necesidad de vectores virales recombinantes y métodos mejorados para realizar estos vectores.

Sumario de la invención En general, la invención se refiere a vectores adenovirales y a proteínas objetivo no virales derivadas de las proteínas de cápside C68, denominadas en la presente memoria construcciones derivadas de C-68.

En un aspecto, la invención proporciona un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus caracterizado porque el cápside comprende una proteína hexon compuesta por uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID Núm. 16 fusionada a un péptido hexon de adenovirus heterólogo. El cápside encapsula una molécula para su suministro a una célula objetivo, en el que la molécula comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITRs) 5' de adenovirus, un minigén, y una ITR 3' de adenovirus. El uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 se seleccionan a partir del grupo consistente en: aminoácidos 131 a 441 de SEQ ID Núm. 16: aminoácidos 138 a 163 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 169 a 176 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 194 a 203 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 233 a 246 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 253 a 264 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 287 a 297 de SEQ ID Núm. 16; y aminoácidos 404 a 430 de SEQ ID Núm. 16.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador fisiológicamente aceptable y un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus según se ha descrito en lo que antecede, y con el cápside encapsulando una molécula para su suministro a una célula objetivo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un adenovirus recombinante según se describe en la presente memoria, para su uso en la preparación de un medicamento.

Todavía en otro aspecto más, la invención proporciona un adenovirus recombinante según se describe en la presente memoria para su uso en el suministro de una molécula a una célula objetivo.

Otras ventajas adicionales de la presente invención se pondrán fácilmente de manifiesto a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 resume la organización genética del genoma C68 de adenovirus de chimpancé. En la Figura 1A el genoma del adenovirus de chimpancé C68 ha sido representado esquemáticamente por medio de la casilla de la parte superior. Las repeticiones terminales invertidas están sombreadas en negro y las regiones cercanas están sombreadas en gris. Las puntas de flecha por encima de la casilla indican la dirección de expresión de los genes primitivos. La línea por debajo de la casilla representa la división del genoma en 100 unidades de mapa. Las flechas por debajo de la línea representan las cinco últimas regiones de gen y las proteínas codificadas en cada región. Los números por debajo de la casilla o de las flechas indican el comienzo (codón promotor o de iniciación) y el final (señal PoliA canónica) para cada región. * representa el último promotor E2A. La Figura 1B ilustra los clones Pstl; la Figura 1C ilustra los clones BamHl. La Figura 1D ilustra los clones HindIII. Para las partes 1B-1D, las regiones no sombreadas indican que un fragmento fue clonado en un vector de plásmido, mientras que las regiones sombreadas indican que el fragmento de restricción no fue clonado. Para cada sección, el nombre del fragmento, alfabético con A que es el fragmento más grande, y el tamaño de fragmento han sido listados por encima de la casilla y los puntos finales de fragmento se han listado por debajo de la casilla.

La Figura 2 proporciona un alineamiento de secuencia de la proteína hexon de C68 [aa 131 a 141 de SEQ ID Núm. 16] con Ad4 [SEQ ID Núm. 34], Ad16 [SEQ ID Núm. 35], Ad3 [SEQ ID Núm. 36], Ad7 [SEQ ID Núm. 37], y Ad2 [SEQ ID Núm. 38]. Las secuencias de aminoácido deducidas de hexones de adenovirus humanos altamente similares fueron comparadas con los adenovirus de chimpancé C68 utilizando CLUSTAL X. Los serotipos y subgrupos han sido indicados en el margen izquierdo, seguidos por el número de residuo. La numeración se refiere a la posición de aminoácido con respecto al inicio de la traducción. Los aminoácidos están sombreados con respecto a C68 para las similitudes de secuencia destacadas (gris) y las identidades (negro) . Las siete regiones hipervariables dentro de los dominios de bucle DE1 y FG1 han sido etiquetadas a lo largo de la parte inferior y corresponden a las secuencias Ad2 siguientes en el alineamiento: HVR1, 137-188; HVR2, 194-204; HVR3, 222-229; HVR4, 258-271; HVR5, 278294; HVR6, 316-327; y HVR7, 433-465 de SEQ ID Núm. 16. Los números de acceso de GenBank para las secuencias mostradas son los siguientes: AAD03657 (Ad4) , S37216 (Ad16) , S39298 (Ad3) , AAD03663 (Ad7) , y PN040525 (Ad2) .

La Figura 3 proporciona un alineamiento de las secuencias de aminoácido del dominio de botón de fibra de chimpancé C68 (Pan-9) [aminoácidos 247 a 425 de SEQ ID Núm. 27] y de los serotipos de adenovirus humano 2 [SEQ ID Núm. 39] y 5 [SEQ ID Núm. 40].

La Figura 4 proporciona un alineamiento de las secuencias de aminoácido de los bucles L1 y una porción del L2 del cápside hexon sobre el serotipo de adenovirus humano 5 [SEQ ID Núm. 41] y de secuencias de adenovirus de C68 de chimpancé (Pan-9) [aminoácidos 125 a 443 de SEQ ID Núm. 16]. La región conservada interviniente forma parte del dominio pedestal conservado entre serotipos de adenovirus.

Descripción detallada de la invención La presente divulgación proporciona nuevas proteínas de cápside de adenovirus derivadas a partir de las secuencias únicas de adenovirus de C68 de chimpancé. Las proteínas de cápside son útiles para una diversidad de propósitos, incluyendo el suministro con objetivo no viral a células y para la creación de vectores virales recombinantes. Estas proteínas y vectores virales son útiles para el suministro de moléculas heterólogas a células objetivo.

I. Adenovirus con nuevas proteínas de cápside Las proteínas de adenovirus de C68 son particularmente adecuadas para su uso en la producción de vectores virales en cápsides derivados de C68. Adecuadamente, estos adenovirus son seudotipados de tal modo que una molécula de ácido nucleico portadora de ITRs de adenovirus procedentes de un serotipo distinto de C68 y un minigén son empaquetados en un cápside adenoviral derivado de C68. Los vectores adenovirales descritos en la presente memoria pueden contener secuencias adenovirales derivadas de una, o más de una cadena adenoviral. En otra alternativa más, otros elementos de C68 descritos en la presente memoria pueden ser utilizados en la producción de vectores recombinantes o de otras construcciones deseables.

Las proteínas de C68 son útiles para una pluralidad de objetivos, incluyendo la construcción de virus recombinantes. Las proteínas de cápside derivadas de C68 son útiles para la producción de vectores híbridos, virus adenoasociados de C68 híbridos, virus Epstein-Barr y retrovirus [Caplen et al., Gene Ther. 6: 454-459 (1999) ; Tan et al, J. Virol., 73: 7582-7589 (1999) ]. Tales virus incluyen cápsides derivados de C68 con vectores encapsulados con ITRs de virus adenoasociados (AAV) [Lieber et al., J. Virol, 73: 9314-9324 (1999) , Recchia et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96: 2615-2620 (1999) ; o ITRs... [Seguir leyendo]

1. Un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus, caracterizado porque el cápside comprende una proteína hexon compuesta por uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID núm. 16, fusionada en un péptido hexon de adenovirus heterólogo, encapsidando dicho cápside una molécula para su suministro a una célula objetivo, en el que la molécula comprende una secuencia de repetición de terminal invertido 5' (ITRs) de adenovirus, un minigén, y una ITR 3' de adenovirus, en el que dicho uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 se selecciona en el grupo consistente en:

(a) aminoácidos 131 a 441 de SEQ ID núm. 16;

(b) aminoácidos 138 a 163 de SEQ ID núm. 16;

(c) aminoácidos 169 a 176 de SEQ ID núm. 16;

(d) aminoácidos 195 a 203 de SEQ ID núm. 16;

(e) aminoácidos 233 a 246 de SEQ ID núm. 16;

(f) aminoácidos 253 a 264 de SEQ ID núm. 16;

(g) aminoácidos 287 a 297 de SEQ ID núm. 16, y

(h) aminoácidos 404 a 430 de SEQ ID núm. 16.

2. El virus recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cápside comprende además una proteína fibra, una proteína penton, o ambas proteína fibra y proteína penton procedentes de un adenovirus distinto del C68.

3. El virus recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el fragmento de las proteínas hexon de C68 es una región de bucle.

4. El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, en el que al menos una región de bucle de la proteína hexon de C68 se ha sustituido por una región de bucle de un adenovirus heterólogo.

5. El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la penton y la fibra son procedentes de un adenovirus humano.

6. El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera e las reivindicaciones 2 a 4, en el que la penton procede del C68 y la fibra procede de un adenovirus diferente.

7. El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la penton está caracterizada por la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 12.

8. El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la fibra procede de C68 y la penton procede de un adenovirus diferente.

9. El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la proteína fibra está caracterizada por la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 27.

10. El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las ITRs de adenovirus son procedentes de un serotipo heterólogo respecto a C68.

11. El adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el adenovirus está funcionalmente suprimido en el gen EIa de adenovirus y en el gen EIb de adenovirus.

12. El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID núm. 16 está fusionado en un péptido de hexon heterólogo por medio de un enlazador.

13. Una composición farmacéutica que comprende un portador fisiológicamente aceptable y un virus recombinante que comprende un cápside adenoviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, encapsidando dicho cápside una molécula para su suministro a una célula objetivo.

14. Un adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en la preparación de un medicamento.

15. Un adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el suministro de una molécula a una célula objetivo.

16. Un adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 15 en el que la molécula codifica un inmunógeno.

17. Un adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la molécula codifica una molécula terapéutica.