Una ribonucleasa diseñada por ingeniería de la superfamilia RNasa A que tiene al menos dos cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa de la ribonucleasa,

siendo el primer cambio una sustitución de aminoácido en la región correspondiente a los restos de aminoácidos 85 a 94 de RNasa A pancreática bovina, y siendo el segundo cambio una alteración, sustitución o intercambio de aminoácido en un lugar seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos que corresponden a los restos 38, 39 y 67 de RNasa A pancreática bovina, teniendo la ribonucleasa diseñada por ingeniería una actividad citotóxica intensificada en comparación con una correspondiente ribonucleasa diseñada por ingeniería que tiene una modificación sólo en la región que corresponde a restos de los aminoácidos 85 a 94

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional nº. de serie 60/690.970 presentada el 16 de junio de 2005. 5

DECLARACIÓN EN CUANTO A INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE

Esta invención se hizo con apoyo económico del gobierno de los Estados Unidos concedida por la siguiente agencia: NIH CA073808. Estados Unidos tiene ciertos 10 derechos en esta invención.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las ribonucleasas son enzimas que catalizan la degradación de ARN. Una ribonucleasa bien estudiada es la ribonucleasa A bovina (RNasa A), cuya función biológica 15 putativa es descomponer la gran cantidad de ARN que se acumula en el intestino del rumiante. La superfamilia de RNasa A es un grupo de enzimas ribonucleasa clasificadas como homólogos a RNasa A. Algunos miembros de la superfamilia poseen varias propiedades biológicas de 20 interés que incluyen actividades antiproliferativas, citotóxicas, embriotóxicas, espermatogénicas y anti-tumorales. Un miembro de esta familia es un homólogo de RNasa A aislada originalmente de oocitos y embriones precoces de la rana leopardo Rana pipiens, que ahora se 25 conoce como Onconase (ONC), un nombre usado para la molécula que exhibe propiedades antitumorales in vitro e in vivo. Actualmente, la ONC se está evaluando como un agente terapéutico del cáncer en ensayos clínicos.

Una limitación significativa sobre la aptitud de la 30 ONC como agente quimioterapéutico es la toxicidad renal limitativa de la dosis. La ONC es retenida en el riñón a una concentración mucho mayor que la de los miembros

mamíferos de la superfamilia RNasa. Puede haber también manifestaciones alergénicas con la ONC, puesto que los ratones producen anticuerpos contra ONC pero no contra RNasa A, con la que ONC comparte aproximadamente 30% de sus aminoácidos. Esto sugiere que otros miembros de la familia 5 de RNasa pueden ser también candidatos para evaluación como agentes terapéuticos clínicos si se les pueden impartir las propiedades citotóxicas similares a las de ONC.

En el cuerpo, los niveles de actividad de RNasa son controlados por un inhibidor de la ribonucleasa (RI), que 10 es una proteína de 50-kDA encontrada en el citosol de todas las células mamíferas. RI es un miembro de una familia de proteínas rica en leucina y está compuesto por 15 repeticiones alternantes dispuestas simétricamente en una molécula con forma de herradura de caballo. RI tiene un 15 gran número de restos de cisteína (32 en IR humano), lo que significa que puede mantener su forma y función sólo en un medio reductor como el citosol. El IR actúa uniéndose a la superfamilia de RNasa, un IR a una molécula de RNasa, y, cuando está así unido, el IR inhibe completamente la 20 actividad catalítica de la ribonucleasa por bloqueo estérico del sitio activo de la enzima. La unión de IR a la RNasa es muy íntima, teniendo una afinidad de unión muy alta.

Algunos miembros de la familia RNasa, notoriamente 25 ONC y la ribonucleasa seminal bovina, poseen la capacidad nativa de evadir IR. El hecho de la evasión de IR es principalmente responsable de la citotoxicidad de ONC y la ribonucleasa seminal bovina. También se ha encontrado que miembros de la superfamilia de RNasa que no son nativamente 30 citotóxicos pueden hacerse citotóxicos por modificación de sus constituyentes aminoácidos de manera que inhiban la unión a IR y, en particular, haciendo sustituciones de

aminoácidos pequeños por grandes en uno de los puntos de más estrecha interacción entre IR y RNasa. Este procedimiento se describe en la patente U.S. nº. 5.840.296, que describe una variante citotóxica, G88R RNasa A, que tiene una afinidad aminorada para IR en comparación con la 5 RNasa A, pero que todavía, es 10 veces menos citotóxica que la ONC. La nomenclatura G88R significa que la molécula de RNasa A se alteró sustituyendo el resto de glicina (G) en la posición del aminoácido 88 por un resto de arginina (R).

Los procedimientos y las herramientas para modelar la 10 estructura tridimensional de las proteínas continúan evolucionando. Al analizar la interacción entre dos moléculas, por ejemplo entre RNasa A e IR, sólo está siendo ahora susceptible de solución el problema de definir los sitios de interacción entre las dos moléculas. A medida que 15 se están desarrollando las herramientas de modelación, puede aumentar la sofisticación del análisis de esa interacción.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una ribonucleasa 20 diseñada por ingeniería de la familia de la RNasa A que tiene al menos dos cambios de aminoácidos de la secuencia nativa de aminoácidos de la ribonucleasa, siendo el primer cambio una sustitución de aminoácido en la región correspondiente a los restos 85 a 94 de la RNasa A 25 pancreática bovina y siendo el segundo cambio una alteración, sustitución o un cambio de aminoácidos en un sitio seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos que corresponden a los restos 38, 39 y 67 de la RNasa AS pancreárica bovina, una ribonucleasa diseñada por 30 ingeniería que tiene una actividad citotóxica intensificada en comparación con una ribonucleasa correspondiente diseñada por ingeniería que tiene una modificación sólo en

la región correspondiente a los restos de aminoácido 85 a 94.

En particular, la invención proporciona las ribonucleasas bovinas diseñadas por ingeniería ribonucleasa A D38R/R39D/G88R y ribonucleasa A D38R/R39D/N67R/G88R. 5

La invención proporciona también una construcción de ADN que codifica la ribonucleasa diseñada por ingeniería de la invención y un alojante de células tal como un ADN.

La invención proporciona además:

un método in vitro para impartir actividad citotóxica 10 a células, que comprende la etapa de suministrar a las células in vitro una ribonucleasa diseñada por ingeniería de la invención;

una ribonucleasa de la invención diseñada por ingeniería para uso en un método de terapia en un cuerpo 15 humano o animal, en particular para uso en la impartición de actividad citotóxica a células.

Es un objetivo de la presente invención definir una ribonucleasa A diseñada por ingeniería que tenga propiedades citotóxicas mejoradas en comparación con 20 anteriores ribonucleasas diseñadas por ingeniería.

Otros objetivos, ventajas y características de la presente invención serán evidentes considerando la memoria siguiente junto con los dibujos que se acompañan.

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BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIFERENTES VISTAS DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es una representación de la estructura tridimensional de la ribonucleasa A y del inhibidor de ribonucleasa.

La Fig. 2 es una representación de la interacción 30 entre la estructura tridimensional de la ribonucleasa A y el inhibidor de ribonucleasa, que muestra los sitios

seleccionados como diana para modificaciones de la ribonucleasa A.

La Fig. 3 representa datos gráficos de los ejemplos siguientes que muestran el efecto de las ribonucleasas sobre la proliferación de células K-532. Los puntos de los 5 datos son la media de al menos tres experimentos, realizado cada uno por triplicado. Cada una de las curvas está marcada con la correspondiente variante de RNasa A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 10

La presente invención está dirigida a ribonucleasas alteradas de la superfamilia de RNasa A que han sido diseñadas por ingeniería para tener un nuevo nivel de citotoxicidad. Esto se consiguió usando una nueva herramienta de modelado de interacción molecular, el 15 algoritmo de Evaluación Rápida de la Densidad Atómica (FADE). Este algoritmo se usó para modelar las posiciones de contacto molecular entre la RNasa A y el inhibidor de ribonucleasa. Sobre la base de este modelo se diseñaron variantes de la secuencia de aminoácidos de RNasa A con el 20 fin de crear nuevas variantes de RNasa A que, mediante impedimento estérico, son capaces de evadir el IR. Se identifican aquí variantes que son más citotóxicas que las variantes de RNasa A antes conocidas.

El análisis empezó con un estudio de la interacción 25 entre la RNasa A y la moléculas de IR. Hay muchas propiedades de una interfaz de proteína-proteína...

1. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería de la superfamilia RNasa A que tiene al menos dos cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa de la ribonucleasa, siendo el primer cambio una sustitución de 5 aminoácido en la región correspondiente a los restos de aminoácidos 85 a 94 de RNasa A pancreática bovina, y siendo el segundo cambio una alteración, sustitución o intercambio de aminoácido en un lugar seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos que corresponden a los restos 10 38, 39 y 67 de RNasa A pancreática bovina, teniendo la ribonucleasa diseñada por ingeniería una actividad citotóxica intensificada en comparación con una correspondiente ribonucleasa diseñada por ingeniería que tiene una modificación sólo en la región que corresponde a 15 restos de los aminoácidos 85 a 94.

2. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la reivindicación 1, en la que el segundo cambio es un intercambio de arginina en el resto 39 con un ácido aspártico en el resto 38. 20

3. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la reivindicación 1, en la que el segundo cambio es una sustitución de una asparagina en el resto 67 por una arginina.

4. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la 25 reivindicación 1, en la que el primer cambio es la sustitución de una glicina en el resto 88 por arginina.

5. La ribonucleasa A pancreática bovina D38R/R39D/G88R diseñada por ingeniería.

6. La ribonucleasa A pancreática bovina D38R/R39D/N67R/ 30 G88R diseñada por ingeniería.

7. Una construcción de ADN que codifica la ribonucleasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una células que aloja la construcción de ADN de la reivindicación 7.

9. Un procedimiento in vitro para impartir actividad citotóxica en células, que comprende la etapa de suministrar a las células in vitro una ribonucleasa 5 diseñada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso en un procedimiento de terapia en un cuerpo humano o animal. 10

11. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la reivindicación 10 para uso en la impartición de actividad citotóxica a células.