PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE CÉLULAS AVIARIAS DIFERENCIADAS Y GENES IMPLICADOS EN EL MANTENIMIENTO DE LA PLURIPOTENCIA.

Procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas a partir de células cepas aviarias cultivadas en un medio de cultivo apropiado,

caracterizado porque comprende una etapa de inducción de la diferenciación de las células cepas por inhibición de la expresión o de la actividad del gen 1P06 de la SEC ID nº 1 expresado en dichas células cepas

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas, a partir de células cepas en cultivo. Unos genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de las células cepas aviarias han sido identificados y clonados. Inhibiendo la expresión de estos genes en las células cepas, éstas pierden sus características de pluripotencia y entran en una vía de diferenciación. Estas células diferenciadas obtenidas in vitro pueden servir de células hospedantes para unos agentes patógenos, en particular unos virus, y ser así utilizadas para la producción de vacunas anti-víricas.

Una célula cepa es una célula pluripotente o multipotente de origen embrionario o adulto que presenta una capacidad de auto-renovación. En otros términos, una célula cepa es una célula no cancerígena capaz de dividirse indefinidamente en cultivo y dar una célula hija que presenta la misma capacidad de proliferación y de diferenciación que la célula madre de la que procede, y que es capaz de dar origen a unas células diferenciadas.

Las células cepas embrionarias de pollo (CESC por Chicken Embryonic Stem Cells) han sido aisladas mediante el cultivo de células de blastodermis de pollo en la etapa X (Pain et al., 1996; solicitud de patente nº FR 94/12598). Estas células CESC presentan todas las características de células cepas embrionarias (ESC). Un medio de cultivo que permite mantener el carácter pluripotente de estas células de pájaros ha constituido el objeto de la solicitud de patente WO 96/12793. La mayoría de las características de estas células se describen en la publicación Lavial et al. (abierta a inspección pública).

Una de las propiedades de las células cepas es su capacidad para proporcionar unas células diferenciadas al mismo tiempo in vitro e in vivo. La obtención de estas células diferenciadas a partir de una población homogénea de precursores se realiza mediante la modificación de las condiciones de cultivo. En efecto, las células CESC siguen en proliferación en un estado no diferenciado sólo en unas condiciones definidas de cultivo in vitro, en presencia de factores de crecimiento y de citoquinas así como de un "feeder" desactivado. En cuanto el medio se empobrece, el equilibrio de proliferación se modifica y la célula entra en diferenciación. Una de las ventajas de la obtención de células diferenciadas in vitro a partir de las células CESC es la paleta tan amplia de fenotipos que pueden ser generados a partir de estas células. En efecto, las células CESC presentan unas propiedades de pluripotencia; éstas pueden diferenciarse en todas las estirpes definidas a nivel embriológico, es decir, en derivados mesodérmicos, ectodérmicos o endodérmicos. Esta propiedad de pluripotencia, específica de una célula cepa, no está presente en las células primarias de un tejido que ya han entrado en una vía de diferenciación. Esta propiedad es máxima en las células cepas embrionarias y está presente, pero de manera más limitada, a nivel de las células cepas adultas tisulares, que son multipotentes. Estas últimas pueden diferenciarse sólo en unas vías de diferenciación que pertenecen a una única y misma estirpe.

Los procesos de reprogramación nuclear permiten que una célula diferenciada vuelva a encontrar una plasticidad de diferenciación. Estos mecanismos empiezan a ser descifrados a nivel molecular en particular por la comprensión de las modificaciones epigenéticas que se producen a nivel del ADN (metilación sobre los islotes CpG) y/o de sus componentes tales como las histonas por unos procesos de acetilación y de desacetilación, de metilación y de desmetilación, de ubiquitinación de las lisinas, de fosforilación de las serinas, de isomerización de las prolinas, y de los cuales una de las consecuencias es reclutar numerosos complejos proteicos que controlan por su asociación sobre unos promotores el nivel de expresión de los genes clave. Unas modificaciones post-traducionales directas de estos actores son asimismo un elemento de regulación suplementario.

Diferentes procedimientos son conocidos por el experto en la materia para inducir o controlar la diferenciación de las células cepas pluripotentes en células diferenciadas in vitro.

Uno de los primeros enfoques consiste en inocular las células en un medio de cultivo que contiene pocas citoquinas o ninguna citoquina y factores de crecimiento necesarios para el mantenimiento de la proliferación de las células. En particular, la ausencia o la baja concentración de una de las citoquinas de la familia ge130 (LIF, IL-6, CNTF, GPA, IL-11, etc.) induce una ralentización de la proliferación y una pérdida progresiva de los marcadores de la pluripotencia.

La diferenciación de las células sometidas a este procedimiento no es homogénea; se obtendrán diferentes tipos celulares según las condiciones de densidad, de secreción autocrina y paracrina de las células, y de sus relaciones entre sí. La heterogeneidad de las células obtenidas se puede estimar por la detección en el conjunto del cultivo de la mayoría de los marcadores precoces de estirpes, tales como por ejemplo los genes Brachyury y Goosecoid específicos de la estirpe mesodérmica, algunos genes Pax y Sox específicos de la estirpe neurectodérmica, y Hnf3 específico de la estirpe endodérmica.

Un segundo enfoque consiste en realizar unos cuerpos embrioides mediante la inoculación de las células en una caja que no está tratada para el cultivo celular. Las células desasociadas se suspenden o bien en un gran volumen de medio empobrecido (menos suero -de 0,5 a 5% por ejemplo -y una ausencia de factores de crecimiento y de citoquinas específicas) y sometido a una agitación lenta, o bien en un pequeño volumen de medio empobrecido, que se utiliza entonces en la técnica de las gotas colgantes. Diferentes ejemplos se proporcionan en las patentes US nº 5.456.357; US nº 5.914.268 y US nº 6.458.589. Otro acondicionamiento es la formación de los cuerpos embrioides directamente en un tubo cónico (Kurosawa et al., 2003), sobre una superficie tratada particular (Konno et al., 2005) o mediante encapsulación en unas microbolas de alginato (Magyar et al., 2001). Al impedir así la adhesión de las células y su polarización baso-lateral, las células cepas embrionarias proliferan y adoptan una estructura tridimensional que imita las diferentes hojas embrionarias (Dang et al., 2002). Los tipos celulares así obtenidos son muy heterogéneos. Además, se observa una heterogeneidad en la cinética de obtención de las diferentes etapas de diferenciación.

Un tercer enfoque es la utilización de inductores químicos de diferenciación. Por sustancia inductora química, se entiende cualquier molécula química no peptídica que no se parece a un factor de crecimiento o a una citoquina, ya sea de origen natural u obtenida mediante síntesis química.

Por ejemplo, se utiliza el DMSO (dimetilsulfóxido) como un inductor general que permite la obtención de poblaciones diferenciadas mixtas con varios tipos celulares derivados (Dinsmore et al., 1996). El ácido retinoico permite, solo o en combinación con el AMPc por ejemplo, de manera no exclusiva, obtener la diferenciación de las células cepas en particular en derivados mesodérmicos, con la obtención de adipocitos en unas condiciones de cinética precisas (Dani et al., 1997), de cardiomiocitos, de diferentes células musculares caracterizadas por una actividad contráctil y la presencia de miosina específica (Rohwedel et al., 1994; Drab et al., 1997).

La mayoría de los protocolos publicados actualmente y que permiten la obtención de células con un fenotipo particular a partir de células cepas embrionarias de ratones asocian unos inductores químicos y unas combinatorias complejas de factores de crecimiento. Unas variaciones en las cinéticas de inducción y de puesta en presencia de estos agentes permiten modular los fenotipos obtenidos. Se proporcionan unos ejemplos con la cinética de obtención de células adipocitarias (Dani et al., 1997), de células osteoblásticas (ZurNieden et al., 2003; Philips et al., 2001) y de precursores neuronales que presentan diferentes fenotipos (Fraichard et al., 1995; Plachta et al., 2004; Glaser y Brustle, 2005).

La reproducibilidad de dichos enfoques resulta difícil a veces y no permite obtener unos enriquecimientos en células diferenciadas satisfactorios para unas aplicaciones industriales, tales como la replicación de virus particulares o la producción de moléculas de interés. Además, los procesos comprenden numerosas etapas, que implican la utilización...

1. Procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas a partir de células cepas aviarias cultivadas en un medio de cultivo apropiado, caracterizado porque comprende una etapa de inducción de la diferenciación de las células cepas por inhibición de la expresión o de la actividad del gen 1P06 de la SEC ID nº 1 expresado en dichas células cepas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la inhibición de la expresión o de la actividad del gen se realiza por medio de por lo menos un ARN interferente, seleccionado preferentemente de entre un ARN antisentido, un ARN bicatenario, un "small interfering" ARN, un "small hairpin" ARN o un ARN ribosómico.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico que codifica para el ARN interferente presenta la secuencia SEC ID nº 3.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico que codifica para el ARN interferente está integrada en un vector de expresión, bajo el control de un promotor que permite la expresión de dicho ARN interferente en una célula hospedante.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica para el ARN interferente está integrado en una célula hospedante.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las células cepas sufren por lo menos una etapa de activación o de inhibición de genes específicos, con el objetivo de obtener una diferenciación específica de dichas células.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las células cepas se cultivan en unas condiciones apropiadas para obtener una diferenciación específica de dichas células.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende una etapa de selección y de destrucción de las células no inducidas en diferenciación.

10. Molécula de ácido nucleico que codifica para un ARN interferente tal como el definido según la reivindicación 3.

11. Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10, dispuesta bajo el control de un promotor que permite la expresión de dicho ARN interferente en una célula hospedante, preferentemente bajo el control de un promotor inducible.

12. Células cepas aviarias transformadas con un vector de expresión según la reivindicación 11.