EXPANSION SIN SUERO DE CELULAS EN CULTIVO.

Un procedimiento de identificación de un agente como capaz de evitar la diferenciación mientras promueve la proliferación de una célula madre de mamífero durante el cultivo ex vivo,

comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto un agente con al menos una de las subunidades PR72/130 de la proteína fosfatasa serina/treonina PP2A y detectar la unión de dicho agente a dicha al menos una subunidad

Expansión sin suero de células en cultivo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos y procedimientos para identificar compuestos capaces de promover la proliferación y evitar la diferenciación de células madre/progenitoras.

Descripción de la técnica relacionada

Las células madre han recibido un interés significativo durante los últimos años debido a su potencial, en microentornos celulares adecuados, para diferenciarse y desarrollarse en un gran conjunto de tipos de células y tejidos. Diversas aplicaciones biomédicas importantes serían posibles gracias a la capacidad de generar suficientes agrupamientos de células madre adultas, incluyendo terapia de sustitución celular, terapia génica, y modificación genética de tejidos. De acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud, el uso terapéutico de células madre se convertirá en una piedra angular de la medicina en las próximas dos décadas:

Dado el enorme potencial de las células madre para desarrollar las nuevas terapias para las enfermedades más devastadoras, cuando se identifica una fuente de células madre fácilmente disponible, no es demasiado poco realista decir que esta investigación revolucionará la práctica de la medicina y mejorará la calidad y duración de la vida (Nacional Institutes of Health. Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions. 17 de junio de 2001).

Sin embargo, el desarrollo de dichas aplicaciones para células madre adultas se ha visto gravemente afectado debido a la incapacidad para propagar y expandir las células madre adultas funcionales en cultivo. Hasta la fecha, esto ha resultado ser un desafío singular en la investigación de las células madre (Sherley, J. (2002) Stem Cells, 20: 561-572). Durante décadas, los científicos han intentado desarrollar células madre en cultivo para aumentar el número de células para transplante. El desafío de esta tarea yace en la predisposición de las células madre para diferenciarse. Este problema puede asociarse con la cinética celular asimétrica inherente de las células madre en tejidos somáticos postnatales (Sherley, J. (2002) Stem Cells, 20: 561-572). Los procedimientos científicos existentes usados para aumentar el número de células madre incluyen cultivar células en capas estromales 2-D y desarrollarlas en presencia de diversos cócteles de citoquina (Rebel, VI, et al. (1994) Blood, 83(1 ):128-136). Sin embargo, ninguno de los procedimientos ex vivo existentes puede evitar la diferenciación de células madre mientras promueve la proliferación (Rebel, VI. et al. (1996) J Hematother, 5(1):25-37). Se conocen procedimientos de selección de compuestos útiles en el cultivo de células madre. Por ejemplo, el documento WO 03/104442 describe un procedimiento de selección de compuestos usando receptores particulares de tirosina quinasa como una diana para seleccionar agentes de unión. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de otros compuestos y procedimientos para identificar compuestos capaces de propagar y expandir células madre adultas en cultivo.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de identificación de un agente como capaz de evitar la diferenciación mientras que promueve la proliferación de una célula madre de mamífero durante el cultivo ex vivo. El procedimiento comprende poner en contacto un agente con al menos una de las subunidades PR72/130 de la proteína fosfatasa serina/treonina PP2A y detectar la unión de dicho agente a dicha al menos una subunidad.

La unión puede detectarse por inmunotransferencia. Adicionalmente, el agente puede seleccionarse entre el grupo constituido por compuestos de fórmula 1-5, 7-12, 15 y 17-28.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos no representan directamente realizaciones de la invención, pero demuestran la actividad de compuestos que pueden identificarse de acuerdo con los procedimientos de la invención e indican ensayos que pueden usarse para demostrar la actividad de dichos compuestos.

Figura 1. Las Figuras 1A-D muestran que IQ-1 mantiene el estado no diferenciado de las ESC. Figura 1A, Estructura de IQ-1. Figura 1B, la dependencia de la dosis de IQ-I mantiene la actividad de la fosfatasa alcalina. Figura 1C, la dependencia de la dosis de IQ-I mantiene la expresión de SSEA-1. La expresión de SSEA-1 se analizó 7 días después de la adición de IQ-1. Figura 1D, IQ-1 permitió proliferar a las ESC en el estado no diferenciado durante al menos 65 días, sin suministradores de FEM o FIL. Las ESC, en medios complementados con 4 µg/ml de IQ-1, se hicieron pasar 2-3 veces cada semana a 1 x 10⁵ -1 x 10⁶ células por platillo de 6 cm y se contaron. Todas las barras de error representan la media ± DT.

Figura 2. Las Figuras 2A-C muestran que IQ-1 mantenía la auto-renovación de las ESC independientemente de FIL. Figura 2A, IQ-1 aumenta la expresión génica de Nanog significativamente comparado con FIL. Se aisló ARNm de las ESC, se cultivó en un sistema sin suministrador, y en presencia de IQ-1 (4 µg/ml) o FIL (1000 U/ml) durante 21 h. Se realizó RT-PCR en tiempo real para Nanog. El control del nivel de expresión de Nanog en el día 0 se ajustó a 1. Figura 2B, la retirada de IQ-1 disminuye la expresión génica de Nanog en las ESC. IQ-1 se retiró de las ESC que se habían cultivado en el sistema sin suministrador y en presencia de IQ-1 (4 µg/ml), durante tres días. Al final de este periodo, el ARNm se aisló y se realizó RT-PCR en tiempo real para ensayar la expresión génica de Nanog. Figura 2C, los efectos de IQ-1 no estaban mediados por la señalización de la ruta Stat3 según se juzgó por un ensayo con informador de luciferasa. Las ESC sin suministrador, transfectadas con el informador pSTAT3-TA-Luc, se expusieron a IQ-1 a las dosis indicadas, o FIL. Todas las barras de error representan la media ± DT.

Figura 3. Las Figuras 3A-C muestran que IQ-1 modula la señalización de Wnt por interacción con PR72/130. Figura 3A, el aislamiento por cromatografía de afinidad de la diana o dianas moleculares de IQ-1 se realizó como se describe en los Procedimientos Experimentales. Las dos bandas a 72 kDa y 130 kDa (marcado) se identificaron por secuenciación espectral de masa como las subunidades reguladoras PR72/130 empalmadas diferencialmente de la proteína fosfatasa serina/treonina, PP2A. Figura 3B, se realizó la inmunotransferencia, usando antisuero PR72/130, para confirmar la identidad de las dos bandas. Figura 3C, IQ-1 provoca defectos de desarrollo en pez cebra. Los embriones de pez cebra en fase de 1 célula se trataron con IQ-1 1 µM (Inferior) o DMSO como control (Superior) durante 24 h. Los resultados son representativos de al menos 10 embriones, a partir de tres experimentos independien- tes.

Figura 4. Las Figuras 4A-D muestran que el mantenimiento con IQ-1 de las ESC es dependiente de Wnt/ß-catenina/CBP. Figura 4A, Modelo de Cambio de Coactivador Wnt/ß-catenina. Figura 4B, IQ-1 aumentaba el complejo CBP/ß-catenina a costa del complejo p300/ß-catenina. Las células P19 se trataron con Wnt3A complementado con IQ-1, ICG-001 de CBP/ß-catenina o DMSO como control. Los lisados nucleares se co-inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-CBP o anti-p300 y se inmunotransfirieron para ß-catenina. Figura 4C, la fosforilación de Ser89 de p300, de una manera dependiente de PKC, aumentaba la interacción p300/ß-catenina. Después de la fosforilación in vitro con PKCa, p300 de tipo silvestre (1-110 aa) y p300 mutante (p300 S89A) se mezclaron con lisados de P19 y se co-inmunoprecipitaron usando el marcador HA. Se realizó el análisis por transferencia de Western para p300 (Superior) o ß-catenina como control de carga (Inferior). Carril 1, unión p300/ß-catenina Carril 2, unión de p300 fosforilado con PKCa/ß-catenina Carril 3, unión de p300 de S89A/ß-catenina Carril 4, unión de p300 de S89A fosforilado con PKCa/ß-catenina. Figura 4D, IQ-1 disminuyó la fosforilación de p300, las células P19 se trataron con IQ-1 o DMSO (control) y se expusieron a Wnt3A purificado durante 24 horas. Los lisados celulares se inmunotransfirieron usando anticuerpos específicos para p300, o p300 fosforilado en la posición Ser 89 Carril 1 control negativo Carril 2, Wnt3a más DMSO como control, panel superior inmunotransferencia de p300 con fosfo Ser89, panel central inmunotransferencia de p300 Carril 3, Wnt3a más IQ-1, panel superior inmunotransferencia de p300 con fosfo Ser89, panel central inmunotransferencia de p300.