Productos de medios de cultivo y manipulación de embriones y gametos sin proteínas.
Medio de cultivo celular sustancialmente sin proteínas para células reproductoras humanas,
adecuado para suutilización durante el tratamiento in vitro de células reproductoras humanas para su utilización en fertilización in vitroy otras tecnologías de reproducción asistida, que comprende sales minerales, aminoácidos, antioxidantes, vitaminas,nutrientes, antibióticos, D-manitol y metilcelulosa que presenta un peso molecular de 14.000 Daltons.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/087818.
Solicitante: ALI BIN M. ABDULLAH, JAFFAR.
Nacionalidad solicitante: Malasia.
Dirección: A4-3 KONDO DANAU MURNI, TAMAN DANAU DESA 58100 KUALA LUMPUR MALASIA.
Inventor/es: ALI BIN M. ABDULLAH,JAFFAR.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N5/02 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin.
- C12N5/075 C12N 5/00 […] › Ovocitos; Ovogonias.
- C12N5/076 C12N 5/00 […] › Células espermáticas; Espermatogonias.
PDF original: ES-2420689_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Productos de medios de cultivo y manipulación de embriones y gametos sin proteínas.
Campo de la invención La presente invención se refiere a medios sin proteínas (PFM) especializados y optimizados para la reproducción humana y los programas de fertilidad. Los productos de medios sustancialmente sin proteínas descritos en la presente memoria son útiles para prevenir la transmisión de patógenos unidos a proteínas incluyendo entre otros y en particular priones a pacientes que se someten a tratamiento de infertilidad, a recién nacidos concebidos por tecnologías de reproducción asistida (ART) y a trabajadores en estas áreas de trabajo, específicamente las relacionadas con la aplicación en la ART humana.
Antecedentes de la invención Los medios de cultivo de embriones disponibles en el mercado convencionales para procedimientos de ART humana contienen albúmina de suero humano (HSA) obtenida de fuentes tisulares y sanguíneas humanas. En algunos laboratorios también se usa albúmina de suero bovino (BSA) como una fuente de proteína en procedimientos de cultivo de embriones humanos (Loutradis et al., 1992; Quinn, 1994) , obtenida de forma similar de fuentes tisulares o sanguíneas de vacas. Se ha indicado que la eficacia de los medios que contienen HSA y BSA es similar (Staessen et al., 1998) . El uso en el medio de cultivo de proteína obtenida de donantes (humanos o bovinos) tiene el potencial de transmitir enfermedades a pacientes que se someten a tratamiento de concepción asistida. La generación de embriones humanos viables en un sistema de cultivo químicamente definido (desprovisto de proteína añadida o albúmina, o extracto de proteína derivado de ser humano o animal) que comienza con la recogida de oocitos, seguida de lavado de espermatozoides, inseminación, fertilización hasta el estadio de embrión escindido y finalmente transferencia de embriones no se ha descrito, aunque se han presentado unos medios definidos químicamente para ratón, conejo y primates en años recientes (Spindle, 1995; Li et al, 1996; Schramm y Bavister, 1996) . Las reivindicaciones anteriores de un medio sin proteínas definido químicamente (PFM) para aplicación humana, de hecho, no eran verdaderamente sin proteínas, debido a que el espermatozoide pretendido para fertilización se preparaba aún en medio que contenía proteínas del suero (Mohr & Trounson, 1986; Serta y Kiessling 1997 (Resumen) ; Parinaud et al. 1999) . Por lo tanto no se ha descrito hasta ahora un medio totalmente sin proteínas para procedimientos de ART.
La disponibilidad de un medio químicamente definido usado para generar embriones humanos de estadio de escisión temprano viables es necesaria en la técnica para asegurar la seguridad de pacientes que se someten a tratamiento de reproducción asistida evitando el uso de proteína donante potencialmente peligrosa. La preocupación sobre posible transmisión de enfermedades patógenas, en particular enfermedades virales, tales como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) humano y hepatitis o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) transmitida por priones u otros en productos derivados de sangre ha conducido a que varios proveedores de servicios de atención sanitaria en el área de ART en todo el mundo busquen una alternativa o alternativas a la proteína de donante para sus procedimientos de cultivo y manipulación de embriones.
La transmisión de una enfermedad viral mortal (SIDA) a hemofílicos a través de productos derivados de la sangre está bien documentada (Véase, por ejemplo, Craven et al., 1997, Med. Sci. Law 37: 215-227; Keshavjee et al., 2001, Soc. Sci. Med. 53.: 1081-1094; Weinberg et al., 2002, Ann. Intern. Med. 136: 312-319; Evatt, 2006, Semin. Hematol
43: S4-9) . Se descubrió que la hormona del crecimiento humana extraída de la hipófisis era capaz de transmitir CJD a seres humanos (Esmonde et al., 1994) y las inyecciones de gonadotropina humana también podrían transmitir CJD entre personas (CDC, 1985) . CJD puede transmitirse a través de la sangre (aunque el título de priones de CJD es bajo en sangre; Heye et al., 1994) . En el pasado se produjo una epidemia de hepatitis B en aproximadamente 200 pacientes de IVF que recibieron embriones cultivados en medio que contenía suero agrupado contaminado con virus de hepatitis B (van Os et al, 1991) . Recientemente la comunidad científica se enfrentó al dilema de tener que informar a sus pacientes de que una preparación comercial de un medio de cultivo usado para cultivo y manipulación de embriones puede estar contaminado con albúmina donada por una persona que posteriormente murió de CJD (Kemmann, 1998) .
Existen varios informes de desarrollo de blastocistos de ratón de estadios de cigoto y escindido en un medio sin proteínas. Los primeros informes incluyen los de Brinster (1965) y, Cholewa y Whitten (1970) que usaron polivinilpirrolidona (PVP) , que es un coloide de alto peso molecular, como lubricante y para aumentar la viscosidad del medio. Posteriormente a este trabajo varios otros trabajadores han cultivado con éxito embriones de ratón así como otros mamíferos en medios sin proteínas (Dandekar y Glass, 1990; Spindle, 1995; Li et al., 1996; Schramm y Bavister, 1996) . En años recientes, además de PVP, también se ha usado alcohol polivinílico (PVA) (Bavister, 1995) para reemplazar la proteína del suero en medio de cultivo. Por ejemplo, Biggers et al. (1997) investigaron el efecto de reemplazar la albúmina de suero bovino (BSA) con alcohol polivinílico (PVA) y/o aminoácidos en el desarrollo de cigotos de ratón. Observaron que el PVA no podría sustituir completamente la BSA en el medio de cultivo de embrión de ratón. El efecto de PVA en la velocidad de desarrollo de blastocistos solo fue ligeramente menor que con BSA pero la velocidad de eclosión parcial fue significadamente menor. La sustitución de BSA con PVA redujo la respuesta global pero no condujo a perturbaciones importantes.
Además de sus muchos papeles biológicos, las proteínas del suero confieren atributos físicos útiles tales como lubricación y viscosidad en el medio de cultivo. La viscosidad y lubricación aumentada en el medio de cultivo se requiere para la facilidad de manejo y manipulación del embrión y para evitar que se adhiera a las paredes de la placa de cultivo y catéteres de transferencia de embriones. La incorporación de PVP y PVA sirve únicamente para duplicar los atributos físicos de proteínas del suero. Sin embargo, PVP y PVA no son fuentes de nitrógeno fijado y no realizan los diversos papeles biológicos de la proteína. Además, las propiedades teratológicas de PVP y PVA no se han examinado completamente, lo que hace su uso en reproducción asistida terapéutica humana cuestionable (Gardner y Lane, 1998a) .
Algunos investigadores han intentado generar embriones humanos viables en un sistema de cultivo sin proteínas, más recientemente Serta et al. (1997) y Parinaud et al. (1998a) . Sin embargo Serta y colaboradores (1997) prepararon sus espermatozoides para inseminación mediante un descenso a través de una columna de BSA (aunque se realizó cultivo posterior en un medio sin proteínas) . Estos trabajadores consiguieron una tasa de embarazos de 31 % (n=45) algunos de los cuales han llegado a término con el nacimiento de descendencia normal. Parinaud et al. (1998a) obtuvieron fertilizaciones con espermatozoides preparados en un medio sin proteínas cuando se realizó inseminación en el mismo medio. Sin embargo los cigotos resultantes se cultivaron en medio BM1, y aunque esta referencia no especifica si su medio BM1 contenía proteína, una publicación previa del mismo grupo sugiere que el medio BM1 contenía HSA a 1% (Parinaud et al., 1998b) .
Algunos trabajadores han mostrado que el reemplazo de proteínas de suero con un único antioxidante y quelante tal como EDTA (Mehta y Kiessling, 1990; Serta et al., 1997) no altera la fertilización y escisión de embriones viables en el ratón y ser humano. Sin embargo Serta et al. (1997) sugirieron que el catéter de transferencia de embriones se aclare exhaustivamente con el medio sin proteínas, lo que implica la tendencia en los embriones a pegarse a la pared interna del catéter de transferencia de embriones. La proteína del suero también tiene un papel en el mantenimiento del pH en el medio de cultivo (Moessner et al., 1993) . Además de su papel como un nutriente en sistemas biológicos, la proteína tiene varios otros papeles tales como antioxidante que rompe cadenas y un quelante de iones metálicos (Barber, 1961; Vidlakova et al., 1972; Wayner et al., 1987) .
Las funciones fisiológicas de albúmina y proteínas del plasma en general están bien documentadas. El papel de la albúmina en la prevención de la peroxidación de membrana indica un papel directo... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Medio de cultivo celular sustancialmente sin proteínas para células reproductoras humanas, adecuado para su utilización durante el tratamiento in vitro de células reproductoras humanas para su utilización en fertilización in vitro y otras tecnologías de reproducción asistida, que comprende sales minerales, aminoácidos, antioxidantes, vitaminas, nutrientes, antibióticos, D-manitol y metilcelulosa que presenta un peso molecular de 14.000 Daltons.
2. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, en el que dicha metilcelulosa está caracterizada de manera que una solución al 2% presente una viscosidad de 15 centipoises a 25ºC.
3. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, en el que dicha metilcelulosa es de fórmula I:
en la que cada R es independientemente H o CH3 y n es un número entero que presenta un valor de 34 a 43 y en la que la sustitución de metoxi es de 27, 5% a 31, 5% en peso.
4. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 3, en el que el número medio de sustituyentes de CH3 unidos a cada resto de azúcar del compuesto de fórmula I es de 1, 5 a 1, 9.
5. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4 en el que dicha metilcelulosa está presente en la solución a una concentración de 0, 01 g/l (0, 71 micromolar) a 0, 5 g/l (0, 036 mM) .
6. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en el que los aminoácidos son L-arginina, L-cistina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, L-alanina, L-taurina, L-ácido glutámico, L-glutamina o glicina o cualquier combinación de los mismos.
7. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4 en el que las sales minerales que comprenden el medio son cloruro cálcico, sulfato de magnesio, cloruro potásico, cloruro sódico y fosfato sódico.
8. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en el que las vitaminas que comprenden el medio son cloruro de colina, mioinositol, niacinamida, ácido D-pantoténico, piridoxina HCl, riboflavina, tiamina HCl, ácido fólico, vitamina B12, vitamina E o cualquier combinación de los mismos.
9. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en el que los nutrientes que comprenden el medio son D-glucosa, piruvato, fructosa, ácido láctico o cualquier combinación de los mismos.
10. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en el que el antioxidante en la solución es el glutatión.
11. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, que comprende además EDTA.
12. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, que comprende además HEPES.
13. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, que comprende además rojo fenol u otro indicador de pH.
14. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, que comprende además sulfato de gentamicina, en el que el sulfato de gentamicina está presente en la solución a una concentración de 1, 5 mg/l a 4 mg/l.
15. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, que comprende además penicilina G, en el que la penicilina G está presente a una concentración de 75 mg/l.
16. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, que comprende además D-manitol.
17. Medio sustancialmente sin proteínas según la reivindicación 1, 2, 3 o 4, que comprende además bicarbonato sódico.
18. Medio según la reivindicación 1 para la utilización en un método de tecnología de reproducción asistida que comprende la etapa de manipular las células reproductoras humanas con el medio de cultivo sustancialmente sin proteínas.
19. Medio para la utilización según la reivindicación 18, en el que la célula reproductora humana es un óvulo no
fertilizado o una pluralidad de espermatozoides o un óvulo fertilizado y en el que el medio es específico para la inseminación interuterina.
20. Procedimiento para realizar el medio de cultivo celular sustancialmente sin proteínas para células reproductoras humanas según la reivindicación 1, en el que el medio se prepara a partir de al menos una o una pluralidad de soluciones madre de sales minerales, aminoácidos, antioxidantes, vitaminas, nutrientes, antibióticos, D-manitol y
metilcelulosa que presentan un peso molecular de 14.000 Daltons, en el que dichas soluciones madre se diluyen con agua para formar el medio de cultivo celular sustancialmente sin proteínas.
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