Un proceso para producir una estructura tridimensional de células de tipo miocardio con funciones de contracción y relajación,

acoplamiento eléctrico intercelular y orientación, que comprende cultivar células que se han obtenido a partir de un corazón vivo en un soporte de cultivo celular con una superficie del sustrato recubierta con un polímero termosensible cuya temperatura de disolución crítica superior o inferior en agua es de 0-80°C, y subsiguientemente: (1) llevar la temperatura de la disolución de cultivo por encima de la temperatura de disolución crítica superior o por debajo de la temperatura de disolución crítica inferior; (2) poner la lámina celular cultivada en contacto íntimo con una membrana o malla polimérica; (3) desprender la lámina celular junto con la membrana o malla polimérica sin usar una enzima proteolítica para obtener una lámina celular de tipo miocardio, y (4) producir una estructura tridimensional de células de tipo miocardio permitiendo que la lámina celular de tipo miocardio así obtenida se adhiera a otra lámina celular de tipo miocardio, que se adhiere a un soporte de cultivo celular no recubierto con un polímero termosensible o a un soporte de cultivo celular recubierto con un polímero termosensible cuya temperatura de disolución crítica superior o inferior en agua es de 0-80°C, y repetir este proceso según sea apropiado, apilando así dos o más láminas celulares

CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere a estructuras tridimensionales que comprenden láminas celulares de tipo miocardio, y a tejidos de tipo miocardio para su uso en el campo biológico, médico y en otros, así como a procesos para producirlos y a métodos terapéuticos que los utilizan.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Con el propósito de construir tejidos miocárdicos in vitro, se cultivan células miocárdicas usando soportes tridimensionales hechos de colágeno o ácido poliláctico, y recientemente se han publicado muchos informes sobre esta técnica. Por ejemplo, Eschenhagen y col. informaron sobre la reconstrucción tridimensional en una matriz de colágeno (Eschenhagen y col., Faseb. J., 11, 683-694, 1997). Carrier y col. informaron sobre estructuras que usan soportes tridimensionales hechos de ácido poliláctico (Carrier y col, Biotechnol. Bioeng., 64, 580-589, 1999). Li y col. informaron sobre injertos cardíacos preparados en una malla de gelatina mediante técnicas de bioingeniería (Li y col., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 119, 368-375, 2000). En cada una de las técnicas de la técnica anterior descritas en estas referencias, las células miocárdicas se cultivan en una matriz tridimensional para que realicen comportamientos de contracción y relajación sobre un sustrato de cultivo. Sin embargo, las masas celulares obtenidas mediante estas técnicas están incrustadas en un gel o una esponja de alto peso molecular, y usarlas para un propósito en particular, digamos, para un propósito médico, implica el problema de contaminación por los materiales altos moleculares. Además, no ha habido técnicas disponibles que permitan que las láminas celulares se coloquen una sobre otra.

También se ha informado sobre hallazgos relativos a cultivos celulares de tejidos no miocárdicos tales como la epidermis. Habitualmente, dicho cultivo celular se ha realizado sobre superficies vítreas o en las superficies de polímeros sintéticos sometidos a una variedad de tratamientos. Por ejemplo, en los cultivos celulares se usan ampliamente recipientes que están hechos de poliestireno y a los que se les dan tratamientos superficiales tales como radiación con rayos  y recubrimientos de silicona. Las células cultivadas y crecidas en estos recipientes son raspadas y recuperadas de su superficie mediante un tratamiento con enzimas proteolíticas tales como tripsina, o con sustancias químicas.

La Publicación de Patente Japonesa Nº 23191-1990 describe un método para producir membranas transplantables de tejido queratinoso cultivando queratinocitos en un recipiente de cultivo en unas condiciones en las que se forma una membrana de tejido queratinoso en la superficie del recipiente, y raspando enzimáticamente la membrana de tejido. Específicamente, se desvela una técnica en la que se hacen crecer células 3T3 como capa alimentadora, y se apilan en múltiples capas, y la lámina celular resultante se recupera con una enzima proteolítica dispasa. Sin embargo, el método descrito en la patente ha tenido los siguientes defectos.

(1) la dispasa es de origen bacteriano, y la lámina celular recuperada debe lavarse meticulosamente.

(2) las condiciones del tratamiento con dispasa difieren de una célula cultivada a otra, y el tratamiento requiere pericia.

(3) las células epidérmicas cultivadas son activadas patológicamente mediante un tratamiento con dispasa.

(4) el tratamiento con dispasa descompone la matriz extracelular.

(5) como resultado, la parte enferma en la que se ha injertado la lámina celular recuperada es susceptible de infección.

Con estos convenientes, es difícil que el método descrito en la Publicación de Patente Japonesa Nº 23191/2000 se aplique a la construcción in vitro de tejidos de tipo miocardio.

La Publicación de Patente Japonesa abierta a consulta por el público Nº 192138/1993 describe un método para cultivar células cutáneas preparando un soporte de un cultivo celular con una superficie de sustrato recubierta con un polímero cuya temperatura de disolución crítica inferior o superior en agua es de 0-80°C, cultivar las células cutáneas en el soporte de cultivo celular a una temperatura bien por debajo de la temperatura de disolución crítica superior o bien por encima de la temperatura de disolución crítica inferior, y a continuación desprender las células cutáneas cultivadas llevando la temperatura bien por encima de la temperatura de disolución crítica superior o bien por debajo de la temperatura de disolución crítica inferior. En este método se emplea el cambio de temperatura para desprender las células del sustrato de cultivo recubierto con el polímero termosensible; sin embargo, el método no permite un raspado celular eficiente, y la lámina celular obtenida ha tenido muchos defectos estructurales. Por consiguiente, el método descrito en la Publicación de Patente Japonesa abierta a consulta por el público Nº 192138/1993 también es difícil de aplicar a una construcción in vitro de tejidos de tipo miocardio.

DESVELACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ha realizado en un intento por resolver los anteriormente mencionados problemas de la técnica anterior. Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar una estructura tridimensional de láminas celulares de tipo miocardio hechas de células tisulares miocárdicas que conserven las funciones de contracción y relajación, el acoplamiento eléctrico intercelular y la orientación. Otro objeto de la invención es proporcionar un método en el que una lámina celular de tipo miocardio cultivada y crecida se pone en contacto íntimo con una membrana polimérica, y se raspa y se recupera de la superficie de un soporte fácilmente, y morfológicamente intacta, sin la necesidad de un tratamiento con una enzima tal como la dispasa, sino cambiando la temperatura ambiental y produciendo estructuras tridimensionales a partir de dichas láminas celulares.

Con objeto de lograr estos objetos, los presentes inventores realizaron esfuerzos de I+D en los que fueron revisados desde varios ángulos. Como resultado, se averiguó que podría construirse una lámina celular con menos defectos estructurales y dotada de diversas capacidades que permitirían que funcionara como un tejido de tipo miocardio in vitro mediante un proceso que comprende las etapas de cultivar células tisulares miocárdicas en un soporte de cultivo celular con una superficie de sustrato recubierta con un polímero termosensible, preparando así una lámina celular de tipo miocardio, tratar la lámina para apilar las células de tipo miocardio mediante un método específico, a continuación llevar la temperatura de la disolución de cultivo bien por encima del punto de disolución crítica superior o bien por debajo del punto de disolución crítica inferior, poner la lámina de células cultivadas y apiladas en contacto íntimo con una membrana polimérica, y desprender la lámina junto con la membrana polimérica. También se averiguó que la lámina celular podría construirse mediante un método específico para darle una estructura tridimensional. La presente invención se ha realizado sobre la base de estos hallazgos.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una estructura tridimensional de láminas celulares cultivadas de tipo miocardio hecha de células tisulares miocárdicas que conservan las funciones de contracción y relajación, el acoplamiento eléctrico intercelular y la orientación.

La invención también proporciona una estructura tridimensional de células cultivadas de tipo miocardio que conserva las funciones de contracción y relajación, así como el acoplamiento eléctrico intercelular tridimensional y la orientación, formando dicha estructura cavidades tubulares de células endoteliales vasculares y/o teniendo una capa celular exterior única de tipo epicardio.

La invención proporciona adicionalmente un proceso para producir una estructura tridimensional de láminas celulares de tipo miocardio que comprende cultivar las células en un soporte de cultivo celular con una superficie del sustrato recubierta con un polímero termosensible cuya temperatura de disolución crítica superior o inferior en agua es de 0-80°C, y subsiguientemente:

(1) llevar la temperatura de la disolución de cultivo por encima de la temperatura de disolución crítica superior o por debajo de la temperatura de disolución crítica inferior, y opcionalmente;

(2) poner la lámina celular cultivada en contacto íntimo con una membrana polimérica; y

(3) desprender la membrana celular junto con la membrana polimérica, donde... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir una estructura tridimensional de células de tipo miocardio con funciones de contracción y relajación, acoplamiento eléctrico intercelular y orientación, que comprende cultivar células que se han obtenido a partir de un corazón vivo en un soporte de cultivo celular con una superficie del sustrato recubierta con un polímero termosensible cuya temperatura de disolución crítica superior o inferior en agua es de 0-80°C, y subsiguientemente:

(1) llevar la temperatura de la disolución de cultivo por encima de la temperatura de disolución crítica superior o por debajo de la temperatura de disolución crítica inferior;

(2) poner la lámina celular cultivada en contacto íntimo con una membrana o malla polimérica;

(3) desprender la lámina celular junto con la membrana o malla polimérica sin usar una enzima proteolítica para obtener una lámina celular de tipo miocardio, y

(4) producir una estructura tridimensional de células de tipo miocardio permitiendo que la lámina celular de tipo miocardio así obtenida se adhiera a otra lámina celular de tipo miocardio, que se adhiere a un soporte de cultivo celular no recubierto con un polímero termosensible o a un soporte de cultivo celular recubierto con un polímero termosensible cuya temperatura de disolución crítica superior o inferior en agua es de 0-80°C, y repetir este proceso según sea apropiado, apilando así dos o más láminas celulares.

2. El proceso para producir una estructura tridimensional según la reivindicación 1, en el que la estructura tridimensional se ha orientado en una dirección específica estirando en la dirección específica después de que se haya desprendido del sustrato.

3. El proceso para producir una estructura tridimensional de células de tipo miocardio según la reivindicación 1, en el que el polímero termosensible es poli(N-isopropilacrilamida).

4. El proceso para producir una estructura tridimensional de células de tipo miocardio según la reivindicación 1, en el que la membrana polimérica se elige de entre una membrana de difluoruro de polivinilideno hidrofilizada, poliuretano, una malla de Spandex y un material de tipo malla elástica.

5. Una estructura tridimensional de células de tipo miocardio con funciones de contracción y relajación, acoplamiento eléctrico intercelular y orientación, que es producida mediante el proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. La estructura tridimensional de células de tipo miocardio según la reivindicación 5, que es una estructura tridimensional de células de tipo miocardio en la que se forman cavidades tubulares de células endoteliales vasculares endógenas en dicha estructura tridimensional de células de tipo miocardio, y las células endoteliales vasculares del tejido que rodea al injerto alojado se dejan crecer hacia dentro y forman cavidades tubulares, formando así vasos sanguíneos.

7. La estructura tridimensional de células de tipo miocardio según la reivindicación 5, que es adecuada para su uso en el tratamiento de enfermedades cardiacas y otras enfermedades relacionadas con los órganos circulatorios o enfermedades relacionadas con los órganos digestivos.

8. Uso de células que han sido obtenidas a partir de un corazón vivo para la elaboración de una estructura tridimensional de células de tipo miocardio según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 7 para su uso en el tratamiento de enfermedades cardiacas y otras enfermedades relacionadas con los órganos circulatorios o enfermedades relacionadas con los órganos digestivos.

9. La estructura tridimensional de células de tipo miocardio según la reivindicación 5, para su uso en un método para tratar enfermedades cardiacas y otras enfermedades relacionadas con los órganos circulatorios o enfermedades relacionadas con los órganos digestivos.