ULTRAFILTRACIÓN Y ULTRACENTRIFUGACIÓN PARA PREPARAR VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA.

Ultrafiltración y ultracentrifugación para preparar vesículas de membrana externa Campo técnico La presente invención pertenece al campo de la preparación de vesículas a efectos de inmunización. Antecedentes de la técnica Una de las diversas maneras de enfocar la inmunización contra N. meningitidis consiste en usar vesículas de membrana externa (VME). El Instituto Nacional de Salud Pública de Noruega [p.ej.: Ref. 1] ha producido una eficaz vacuna de VME contra el serogrupo B, pero aunque se trata de una vacuna segura que previene la enfermedad de NmB, su eficacia se limita a la cepa usada para elaborar la vacuna. La vacuna RIVM se basa en vesículas que contienen seis subtipos diferentes de PorA y ha probado ser inmunógena en niños en ensayos clínicos en fase II [2]. Las Referencias 3 y 4 revelan una vacuna contra diferentes serotipos patógenos de meningococo de serogrupo basada en VME que conservan un complejo proteico de 65 kDa. La Referencia 5 revela una vacuna que comprende VME de cepas meningocócicas diseñadas genéticamente, VME que comprenden al menos una proteína de la membrana externa de clase 1 (PME) pero que no comprenden ninguna PME de clase 2/3. La Referencia 6 revela VME que comprenden PME que tienen mutaciones en sus bucles superficiales. La Referencia 7 revela composiciones que comprenden VME complementadas con proteínas de unión a la transferrina (p.ej., TbpA y TbpB) y/o superóxido dismutasa de Cu, Zn. La Referencia 8 revela composiciones que comprenden VME complementadas con diversas proteínas. Las Referencias 9 y 10 también describen preparaciones de VME de meningococo. La Referencia 11 revela un procedimiento para preparar vacunas basadas en VME, particularmente, para meningococo del serogrupo A, que comprenden las 10 siguientes etapas: (a) cultivar células bacterianas; (b) concentrar las células cultivadas de la etapa (a); (c) tratar las células con un detergente de sales de ácido biliar a un pH suficientemente alto para que no precipite el detergente, para desactivar las bacterias, afectar a la membrana externa de las bacterias y formar vesículas de membrana externa de las bacterias, vesículas que comprenden componentes de la membrana externa principalmente presentes en su forma nativa; (d) centrifugar la composición de la etapa (c) a 10.00020.000 xg durante aproximadamente 1 a 2 horas para separar las vesículas de membrana externa de las células tratadas y de los residuos celulares, y recoger el sobrenadante; (e) realizar una centrifugación de alta velocidad del sobrenadante de la etapa (d) y recoger las vesículas de membrana externa en un sedimento; (f) volver a dispersar el sedimento de la etapa (e) en un tampón agitando a temperatura ambiente; (g) realizar una segunda centrifugación de alta velocidad según la etapa (e), recoger las vesículas de membrana externa en un sedimento; (h) volver a dispersar el sedimento de la etapa (g) en un medio acuoso que contiene un agente estabilizador agitando a temperatura ambiente; (i) realizar una filtración estéril por etapas a través de al menos dos filtros de tamaño de poro decreciente de la composición redispersada de la etapa (h), acabando con un filtro de tamaño de poro de aproximadamente 0,2 µm; y (j) opcionalmente, incluir la composición de la etapa (i) en un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o una composición adyuvante. El documento US 2003/0059444A revela la sustitución de una secuencia de etapas de ultracentrifugación mediante cromatografía de intercambio iónico y ultrafiltración. Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento mejorado para preparar VME para su uso en vacunas, en concreto, un procedimiento que pueda preparar una cantidad mayor de VME en menor tiempo y, particularmente, un procedimiento adecuado para su uso a escala industrial. Revelación de la invención La invención se basa en descubrir que, en comparación con la centrifugación usada en la etapa (e) del procedimiento de la Referencia 11, la ultrafiltración permite el procesamiento de cantidades mucho mayores de sobrenadante que contiene VME en mucho menor tiempo (comúnmente, > 15 litros en 4 horas, en comparación con < 1,5 litros en 10 horas). Además, si se permite realizar la etapa (e) más rápidamente, el uso de la ultrafiltración permite omitir la etapa (f), porque las VME permanecen en suspensión. Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento para preparar VME bacterianas según la reivindicación 1 que comprende una etapa de ultrafiltración. La etapa de ultrafiltración se realiza en una suspensión acuosa de VME crudas tras su preparación a partir de bacterias, y las VME permanecen en suspensión tras la etapa de ultrafiltración. 2   Etapa de ultrafiltración La ultrafiltración es un procedimiento de separación mediante el que se elimina el disolvente de una solución (incluyendo una solución coloidal) o de una suspensión, haciéndola fluir a través de una membrana mediante la aplicación de una presión hidráulica. Los componentes de la solución que son significativamente mayores que el disolvente no pueden pasar a través de la membrana. Por consiguiente, la ultrafiltración separa los componentes en base a su tamaño. La etapa de ultrafiltración produce preferiblemente la diafiltración de la solución. En la diafiltración, el disolvente y/o los microsolutos (p.ej., sales) que se retiran durante la ultrafiltración son reemplazados por disolvente y microsolutos nuevos. En general, la extracción y la sustitución tienen lugar a la misma velocidad y, por tanto, el volumen de la solución se mantiene constante. El efecto global del procedimiento es, por tanto, la sustitución del disolvente/de los microsolutos originales por nuevos disolvente/ microsolutos. El procedimiento de la invención puede entonces incluir una etapa de diafiltración. La ultrafiltración es preferiblemente una ultrafiltración de flujo cruzado o flujo tangencial, en la que la solución fluye sustancialmente en paralelo a la superficie de la membrana en lugar de fluir perpendicularmente a la superficie como ocurre en la filtración normal. Las membranas preferidas para su uso en la etapa de ultrafiltración tienen un corte de aproximadamente 300 kDa. Preferiblemente, la etapa de ultrafiltración dura menos de 10 horas, p.ej., entre 2 y 6 horas, preferiblemente, entre 3 y 5 horas, p.ej., entre 3,5 y 4,5 horas. Las membranas pueden ser de cualquier material adecuado, p.ej., poliétersulfona. Etapas anteriores a la ultrafiltración Antes de la etapa de ultrafiltración, el procedimiento de la invención comprenderá comúnmente una etapa inicial de cultivo de células bacterianas (p.ej., en caldo o en cultivo de medio sólido), opcionalmente, seguida por una etapa de recogida y/o concentración de las células cultivadas (p.ej., mediante filtración o mediante centrifugación de baja velocidad para sedimentar las células). Sin embargo, la invención se puede realizar en bacterias que ya hayan sido cultivadas y/o cosechadas por separado. El cultivo bacteriano implica preferiblemente que no se usen ni productos sanguíneos ni material contaminado con un agente de la encefalopatía espongiforme transmisible. La etapa de ultrafiltración se realiza en una suspensión acuosa de VME crudas una vez preparadas a partir de bacterias. Por lo tanto, antes de la ultrafiltración, el procedimiento puede comprender una etapa de preparación de VME en la que se tratan las células para afectar a sus membranas externas. La preparación de las VME de meningococo es ampliamente conocida en la técnica. Los procedimientos para obtener preparaciones adecuadas se revelan, por ejemplo, en las Referencias 1 a 25. Las técnicas para formar VME incluyen tratar bacterias con un detergente de sales de ácido biliar (p.ej., sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., siendo el desoxicolato de sodio [26 y 27] preferido para tratar Neisseria) a un pH suficientemente elevado para no hacer precipitar el detergente [11]. Se pueden realizar otras técnicas sustancialmente en ausencia de detergente [28] usando técnicas tales como el tratamiento con ultrasonidos, la homogenización, la microfluidificación, la cavitación, el choque osmótico, la trituración, la prensa francesa, el mezclado, etc. Para conservar la configuración nativa de las proteínas y de otros antígenos lábiles de la membrana externa, en general, se seleccionarán condiciones suaves para la preparación de las VME. Por tanto, es preferible evitar la desactivación térmica de las bacterias (p.ej., a 56°C o más), como lo es la desnaturalización del diso lvente. Etapas posteriores a la ultrafiltración Tras la etapa de ultrafiltración, se siguen tratando las VME. Por ejemplo, las VME se pueden esterilizar. La esterilización es preferiblemente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar vesículas de membrana externa (VME) bacterianas para su uso en vacunas que comprende las etapas de: (i) ultrafiltración realizada en una suspensión acuosa de VME crudas que ha sido preparada a partir de bacterias gram negativas, en la que las VME permanecen en suspensión tras la etapa de ultrafiltración; (ii) ultracentrifugación de la suspensión y (iii) resuspensión de las VME ultracentrifugadas de los sedimentos de la ultrafiltración. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de ultrafiltración da como resultado una diafiltración. 3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la ultrafiltración es de flujo cruzado o de flujo tangencial. 4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana usada para la ultrafiltración tiene un corte de aproximadamente 300 kDa. 5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las VME son resuspendidas en la etapa (iii) en una solución de sacarosa. 6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las VME se esterilizan tras la etapa (iii). 7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la esterilización es mediante esterilización de filtración. 8. Un procedimiento para preparar VME bacterianas para su uso en vacunas que comprende las etapas de: (a) cultivar las células bacterianas; (b) recoger y/o concentrar las células cultivadas; (c) perturbar las membranas externas de las células cultivadas; y (d) preparar VME mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además la etapa de combinar las VME con vehículos farmacéuticos y/o adyuvantes y/o estabilizador. 10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria es Neisseria meningitidis. 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la bacteria es una N. meningitidis de serogrupo B. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la bacteria es una cepa B:4:P1.4, una cepa B:4:P1.15, una cepa B:4:P1.19,15, una cepa B 4:P1.7b,4 o una cepa B:15:P1.7,16. 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la N. meningitidis tiene una o más mutaciones para disminuir o noquear la expresión de un producto génico. 14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el producto génico es Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, ExbB, ExbD, FrpB, GalE, HtrB, MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, NMB0033, OpA, OpC, PhoP, PiIC, PmrE, PmrF, PorA, PorB, rmpM, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, SynA, SynB, SynC, TbpA y/o TbpB. 18   19