TOXINAS HÍBRIDAS QUE COMPRENDEN SUBUNIDADES DE LA TOXINA SIMILAR A SHIGA CONDENSADAS CON SUBUNIDADES DE LA ENTEROTOXINA TERMOLÁBIL DE ESCHERICHIA COLI Y VACUNAS DE LAS MISMAS.

Subunidad de la toxina bacteriana híbrida que comprende una parte A1 de la toxina Shiga o toxina similar a Shiga condensada a una parte A2 de la enterotoxina termolábil de Escherichia coli

La presente invención se refiere a una subunidad de toxina bacteriana híbrida, a una toxina bacteriana bipartita híbrida y a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica dichas toxinas bacterianas. Además, la invención se refiere a vacunas que comprenden dichas toxinas bacterianas y a su uso en vacunas, a procedimientos para la preparación de dichas vacunas y al uso de dichas toxinas bacterianas para la fabricación de dichas vacunas.

Muchos miembros de las enterobacterias, tales como Shigella y Escherichia coli, se sabe que producen una o más toxinas. Entre estas hay varias potentes citotoxinas y neurotoxinas. Se sabe que Shigella dysenteriae produce la denominada toxina Shiga (Sandvig, K., Toxicon 39: 1629-1635 (2001 )). Un grupo de toxinas de Escherichia coli muy estrechamente relacionadas es tóxico para las células del mono verde africano (vero) y, por tanto, se han conocido como verotoxinas. Estas toxinas muestran una gran semejanza con una toxina citotóxica que anteriormente se descubrió en Shigella dysenteriae de tipo 1, lo que explica el nombre que se les da actualmente: Toxinas similares a Shiga (SLT). Las toxinas similares a Shiga se han descrito en, entre otros, una revisión de Agbodaze, D. (Comp. Immunol., Microbiol. & infectious diseases 22: 221-230 (1999)) y en una revisión de O'Brian, .D. y Holmes, R.K. (Micro-bioI. Review 51: 206-220 (1987)).

No hace falta decir que la invención es aplicable tanto a la toxina Shiga como a las toxinas similares a Shiga. Actualmente se sabe que las toxinas similares a Shiga son la causa de, entre otros, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico en seres humanos (Karmali y col., Lancet I: 1299-1300 (1983)), diarrea en terneros (Chanter, N., Vet. Microbiol. 12: 241-253 (1986) y Mainil y col., Am. J. Vet. Res. 48: 734-748 (1987) y enfermedad de edema en cerdos (Dobrescu, L., Am. J. Vet. Res. 44: 31-34 (1983), Gannon, V.P.J. y col., Can. J. Vet. Res..53: 306-312 (1989), Marques, L. R. M., y col., FEMS Microbiol. Letters 44: 33-38 (1987), Smith, H. W. y col., J. Gen. Microbiol. 129: 31213137 (1983) y Smith, HW. y col., J. Med. Microbiol. I : 45-59 (1968)).

Las manifestaciones clínicas de edema en cerdos, entre otros, disfunción neurológica, son el resultado de microangiopatía y necrosis vasculares producidas por una variante específica de la toxina similar a Shiga Stx2e (Neilsen, N. O., Edema Disease, p. 528-540 (1986) en A. D. Lehman, Straw, B., Glock R.D. y col. (ed.), Diseases of swine, 6ª ed. Iowa State University Press, Ames. USA), (Gannon, V.P.J. y col., Can. J. Vet. Res. 53: 306-312 (1989), Kurtz, H.J. y col., Am. J. Vet. Res. 30: 791-806 (1969) y Marques, L. R. M., y col., FEMS Microbiol. Letters 44: 33-38 (1987)). Esta variante Stx2e, también conocida en la técnica como SLT-IIe, SLT-IIv, verocitotoxina 2e y VT2e, produce una enfermedad que golpea aproximadamente una semana después del destete. La enfermedad, que se caracteriza por el edema y las posteriores alteraciones neurológicas específicas que causa, generalmente se conoce como edema posdestete (PWE) o enfermedad de edema.

La toxina Shiga y todas las toxinas similares a Shiga comparten la misma estructura general. Consisten en una única subunidad A unida a múltiples copias de una subunidad B. Normalmente, una única subunidad A está unida a un pentámero de subunidades B. La subunidad A es la parte de la toxina real: desempeña un papel en la inhibición de la síntesis de proteínas del huésped. La subunidad B, más específicamente cuando está en su forma de pentámero, está asociada con la unión al receptor. Una única subunidad B tiene un tamaño de aproximadamente 7,5 kDa, mientras que la subunidad A tiene un tamaño de aproximadamente 32 kDa.

La secuencia de ADN de la parte A1 (véase más adelante) de la variante de toxina similar a Shiga Stx2e se proporciona en la SEC ID Nº: 1. La secuencia completa de muchas otras variantes de toxina similar a Shiga se puede encontrar con facilidad en el sitio web del National Center for Biotechnology Information, www.NCBI.NLM.NIH.GOV. El experto conocerá la estrategia de búsqueda, pero, simplemente como ejemplo, en el banco de nucleótidos basta con rellenar “toxina similar a Shiga” como términos de búsqueda para encontrar todas las variantes conocidas y su descripción. Como alternativa, es posible simplemente usar la secuencia de la parte A1 de la toxina similar a Shiga de la SEC ID Nº 1 y volcarla contra el banco de genes bacterianos del sitio web del National Center for Biotechnology Information. Esto proporcionará igualmente otras variantes de toxina similar a Shiga.

Figura 1: Muestra una figura esquemática de una toxina similar a Shiga típica; su estructura global, la localización de las partes A1/2 (véase más adelante) de la subunidad A y la localización de las subunidades B.

Por tanto, toda la toxina se describe mejor como una toxina bipartita (es decir, una toxina que consta de dos partes), que comprende una única subunidad A y un pentámero sencillo formado por 5 subunidades B.La subunidad A como tal puede, posteriormente, estar dividida funcionalmente en una parte A1, que es la parte enzimática real, y una parte A2, que es la parte de la subunidad A que está implicada en la unión al pentámero de subunidades B. La unión de la subunidad A, a través de la parte A2 de la subunidad A, a la subunidad B sigue el principio de llave-cerradura: la parte A2 de la subunidad A de la toxina similar a Shiga sólo cabe en la subunidad B de la toxina similar a Shiga, y de ninguna otra subunidad B, aunque esté estrechamente relacionada, tal como, por ejemplo, la subunidad B de la enterotoxina termolábil (LT) de Escherichia coli.

Se sabe que la vacunación con toxinas inactivadas se puede usar para prevenir enfermedades causadas por cepas de E. coli productoras de toxina similar a Shiga. (Awad-Masalmeh, M., en Proc of the 10th Int. Pig Vet. Soc. Congress, Río de Janeiro, Brasil (1988), Awad-Masalmeh, M., Dtsch. Tieraertzl. Wochenschr. 96: 419-421 (1989), Howard, J.G., Br. J. Exp. Pathol. 36: 439-4476 (1955), Islam, M.S., y Stimson, W.H., J. Clin. Lab. Immunol. 33: 11-16 (1990), MacLeod, D.L y Gyles, D.L., Vet. Microbiol. 29: 309-318 (1991), Wadolkowsky, E.A. y coI., Infect. & Immun.

58: 3959-3965 (1990), Bosworth, B.T. Infect. & Immun. 64: 55-60 (1996)). Sheoran Abhineet y col., en "Infection and Immunity" June 2003, Vol. 71, Nº 6, pág. 3125-3130 y Mukherjee y col. en "Infection and Immunity", Feb. 2002 Vol. 70, Nº 2, pág. 612-619 desvelan la producción y formulación en tampón de anticuerpos monoclonales específicos de Stx2.

Se conoce a organización genómica, además de la localización y la secuencia de los genes que codifican las subunidades A y B para las toxinas similares a Shiga (Spicer E.K. y col., J. BioI. Chem,. 257:5716-5721 (1982), Calderwood, S.B. y coI., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4364-4368 (1987), Dallas W.S. y Falkow S., Nature 288: 499-501 (1980), Leong J. y coI., Infect. Immun. 48: 73-77 (1985)).

Por tanto, en principio, teniendo a mano la información genética necesaria y conociendo que la vacunación con toxinas inactivadas se puede usar para prevenir enfermedades causadas por cepas de E. coli productoras de toxina similar a Shiga, la expresión in vitro a gran escala de los genes que codifican las subunidades A y B parece un buen punto de partida para la producción de vacunas. No obstante, contra las expectativas, aunque es muy eficiente para la producción y posterior purificación de las subunidades A y B de la enterotoxina termolábil (LT) comparable de Escherichia coli (véase más adelante), la expresión/purificación de la toxina Shiga y toxinas similares a Shiga resultó ser muy difícil.

En primer lugar, aunque la expresión de la subunidad B de la toxina similar a Shiga en un sistema de expresión bacteriana no es un problema (Acheson y coI., Infect. & Immun. 63: 301-308 (1995)), la subunidad A de la toxina similar a Shiga no puede expresarse, o sólo en cantidades mínimas, en sistemas de expresión bacterianos.

Además, la purificación de la toxina bipartita Shiga y similar a Shiga (al contrario que la purificación de la LT) es difícil y cara. La solicitud de patente PCT WO 98/54215 proporciona modos de superar las dificultades experimentadas con la purificación, aunque depende del uso de columnas de afinidad que usan ligandos de afinidad caros que comprenden disacáridos. Para la preparación de una vacuna basada en la toxina Shiga o la toxina similar a Shiga, este procedimiento de purificación es, desde un punto... [Seguir leyendo]

1. Subunidad de la toxina bacteriana híbrida que comprende una parte A1 de la toxina Shiga o toxina similar a Shiga condensada a una parte A2 de la enterotoxina termolábil de Escherichia coli.

2. Subunidad de la toxina bacteriana híbrida de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que la parte A1 es una parte A2 de Stx2e.

3. Toxina bacteriana bipartita híbrida que comprende cinco subunidades B de la enterotoxina termolábil de Escherichia coli y la subunidad de la toxina bacteriana híbrida de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una subunidad de toxina bacteriana híbrida de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

5. Un fragmento de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, bajo el control de un promotor funcionalmente unido.

7. Un vehículo recombinante vivo que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5

o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 o un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Subunidad de toxina bacteriana híbrida de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una toxina bacteriana bipartita híbrida de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 7 o una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 para uso en una vacuna.

10. Vacuna que comprende una subunidad de toxina bacteriana híbrida de acuerdo con reivindicación 1 o 2 o una toxina bacteriana bipartita híbrida de acuerdo con la reivindicación 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5 o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Vacuna que comprende un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 7 o una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13 Vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizada por que dicha vacuna comprende un antígeno adicional derivado de un virus o microorganismo patogénico para seres humanos o animales, un anticuerpo contra dicho antígeno o información genética que codifica dicho antígeno.

14. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada por que dicho virus o microorganismo patogénico para los cerdos se selecciona del grupo de virus de la seudorrabia, virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, Brachyspira hyodysenteriae, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Brachyspira hyodysenteriae, Shigella sp, Salmonella cholerasuis, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Micoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Staphylococcus hyicus y Clostridium perfringens.

15. Uso de una subunidad de toxina bacteriana híbrida de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una toxina bacteriana bipartita híbrida de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, un molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 7 o una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por Shigella o Escherichia coli.

16. Procedimiento para la preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 10-14, comprendiendo dicho procedimiento la mezcla de una subunidad de toxina bacteriana híbrida de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una toxina bacteriana bipartita híbrida de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 7 o una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.