RATONES TRANSGÉNICOS SCCE Y SU USO COMO MODELOS DE ENFERMEDAD HUMANA.

Ratones transgénicos SCCE y su uso como modelos de enfermedad humana Campo de la invención La presente invención se refiere a embriones de ratón y ratones scce transgénicos, su uso como modelos de estudio de enfermedades humanas, a métodos de uso de estos modelos para identificar compuestos y composiciones eficaces para el tratamiento de estas enfermedades. En particular, la invención se refiere a ratones transgénicos que sobreexpresan un gen scce en la epidermis. Estos animales de modelo presentan un cambio principal en el fenotipo caracterizado por un trastorno cutáneo grave y son útiles para identificar compuestos y composiciones para el tratamiento de diversas enfermedades humanas. Antecedentes generales La piel como órgano es de interés desde los puntos de vista biológico, médico y cosmetológico. Existe un gran número de enfermedades cutáneas que o bien son específicas de órgano, por ejemplo psoriasis y eccemas, o bien son manifestaciones de una enfermedad general, tal como reacciones alérgicas generales. El hecho de que existen enfermedades específicas de la piel puede considerarse una prueba de la existencia de mecanismos moleculares que son únicos para la piel. Análogamente, estudios sobre procesos moleculares específicos de la piel son de importancia para el entendimiento y tratamiento de trastornos cutáneos. Parece razonable asumir que varios de estos procesos de una manera u otra están relacionados a la función más especializada de la piel, que es la formación de una barrera fisicoquímica entre el exterior y el interior del cuerpo. La barrera cutánea fisicoquímica se ubica en la capa más externa de la piel, el estrato córneo. El estrato córneo es la estructura más especializada de la piel. Es el producto final del proceso de diferenciación de la epidermis, que es el epitelio escamoso estratificado que representa la parte más externa de la piel. La mayoría de las células de la epidermis consisten de queratinocitos en diversos estados de diferenciación. Los queratinocitos más bajos, las células basales, residen en una membrana basal en contacto con la dermis, que es el tejido conjuntivo de la piel, y son los únicos queratinocitos que tienen capacidad de división. Una fracción de las células basales abandona continuamente la membrana basal y experimenta un proceso de diferenciación, que eventualmente hace que las células se vuelvan bloques de construcción del estrato córneo. En este proceso los queratinocitos experimentan varios cambios adaptativos. Existe un contenido aumentado de citoesqueleto que consiste de citoqueratinas específicas de la epidermis. Los filamentos intermedios de células contiguas se unen a una unidad funcional mediante un número aumentado de desmosomas. Los cambios más drásticos tienen lugar durante la transición de la capa de células vivas más superior, el estrato granuloso, al estrato córneo no viable en un proceso habitualmente denominado queratinización. Proteínas reticuladas covalentemente se depositan cerca del aspecto interno de la membrana plasmática, formando una envoltura de célula muy resistente. Además se secreta una sustancia rica en lípidos, que se origina en un orgánulo celular específico de queratinocitos, al espacio extracelular y, mediante la formación de láminas de lípidos, que rodean las células del estrato córneo, constituye la barrera de permeabilidad frente a sustancias hidrófilas. Finalmente desparecen todas las estructuras intracelulares excepto los filamentos de citoqueratina empaquetados densamente. Por tanto, las células del estrato córneo, los corneocitos, no son viables. Esto significa que la regulación de diversos procesos en el estrato córneo debe ser el resultado de una programación en un estado en el que los queratinocitos todavía son viables. Se finaliza la renovación de la epidermis, que normalmente avanza en aproximadamente cuatro semanas durante las cuales las células son parte del estrato córneo durante aproximadamente dos semanas, por medio del desprendimiento de células de la superficie cutánea en el proceso de descamación. Este proceso es un ejemplo de programación del estrato córneo. Un prerrequisito para la función del estrato córneo como barrera fisicoquímica es que sus células individuales se mantengan juntas mediante estructuras mecánicamente resistentes, que son desmosomas. La degradación de los desmosomas, que es un prerrequisito para la descamación, debe regularse de modo que se produzca un desprendimiento de células de la superficie cutánea que equilibre la producción de novo del estrato córneo sin interferir con las funciones de barrera del tejido. Trastornos de queratinización En un gran número de estados patológicos en la piel de diversa gravedad, existen alteraciones en el proceso de queratinización. En la psoriasis existe, además de una inflamación crónica típica, sobreproducción de un estrato córneo inmaduro da como resultado las escamas típicas de esta enfermedad. Existe un grupo de enfermedades cutáneas heredadas caracterizado por un estrato córneo engrosado que conduce a la formación de escamas de peces, la denominada ictiosis. En varias de las ictiosis existe una tasa de descamación disminuida. Aunque menos grave que la ictiosis, la piel seca (xerodermia) también se caracteriza por un estrato córneo del cual se desprenden los corneocitos, no como en condiciones normales como células individuales o como pequeños agregados de células, sino como grandes escamas macroscópicamente visibles. Este trastorno es muy común entre ancianos y 2   entre individuos atópicos, es decir individuos con una resistencia aumentada frente a agentes irritantes cutáneos y una disposición para desarrollar una forma característica de eccema endógeno. En las enfermedades del acné existe una queratinización alterada en los conductos de las glándulas sebáceas, que conduce a la formación de comedones y taponamientos. La formación de comedones precede a, y se cree que provoca, la lesión de acné inflamatoria. Las enzimas proteolíticas están implicadas en la queratinización. Existen varias fases en el proceso de queratinización y durante la renovación del estrato córneo en el que las enzimas proteolíticas parecen desempeñar papeles importantes. Ciertamente la desaparición de todas las estructuras intracelulares excepto los filamentos de citoqueratina que se produce durante la transición entre capas epidérmicas cornificadas y viables, debe implicar proteólisis. La transformación de profilagrina a filagrina, una proteína que se cree que funciona en el tipo especial de agregación de filamentos de citoqueratina durante la queratinización, puede catalizarse mediante una proteinasa específica. En el estrato córneo la filagrina se degrada adicionalmente en componentes de bajo peso molecular que son importantes probablemente como humectantes naturales. Además existen modificaciones proteolíticas de polipéptidos de citoqueratina durante el proceso de queratinización. Finalmente, es probable que acontecimientos proteolíticos desempeñen papeles cruciales en la degradación de estructuras de cohesión intercelular en el estrato córneo en procesos que conducen eventualmente a la descamación. Cohesión de células del estrato córneo y descamación. El papel de desmosomas La cohesión intercelular en el estrato córneo así como en las partes viables de la epidermis está mediada en un grado significativo por desmosomas. Un desmosoma consiste en dos mitades simétricas, cada una de las cuales está formada por dos células contiguas. Cada mitad desmosómica tiene una parte intracelular unida a los filamentos de citoqueratina y una parte compuesta por glicoproteínas ancladas intracelularmente y con partes extracelulares y transmembrana. Las partes extracelulares de estas proteínas, las desmogleínas, son moléculas de adhesión, y mediante su interacción entre sí en el espacio extracelular se forma una estructura de cohesión. La degradación de los desmosomas parece seguir vías algo diferentes en el estrato córneo de las palmas y las plantas de los pies en comparación con estrato córneo no palmo-plantar. En este último tejido aproximadamente el 85% de los desmosomas desparecen poco después de que las células se vuelvan completamente cornificadas. Los desmosomas restantes, que están preferiblemente ubicados en los bordes vellosos de las células extremadamente aplanadas, permanecen aparentemente intactos hasta el nivel en el que tiene lugar la descamación. En el estrato córneo palmo-plantar los corneocitos están mucho menos aplanados, y no existe degradación ehxaustiva de los desmosomas en capas más profundas del tejido. En ambos tejidos la descamación está asociada con la degradación desmosómica. En la piel ictiósica así como en la piel seca, se ha mostrado que aumenta el número de desmosomas en las... [Seguir leyendo]

1. Ratón transgénico que tiene integrado dentro de su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, en el que dicha proteína presenta actividad de enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE), y en el que dicha secuencia de nucleótidos heteróloga está operativamente unida al promotor temprano de SV40. 2. Ratón transgénico según la reivindicación 1, en el que dicho promotor temprano de SV40 operativamente unido impulsa la expresión de dicha proteína heteróloga en la epidermis. 3. Ratón transgénico según la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de ADN tal como se muestra en SEQ ID NO: 1, que codifica para la SCCE humana. 4. Ratón transgénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de ADN codifica para el péptido mostrado en SEQ ID NO: 2. 5. Ratón transgénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el mamífero muestra un fenotipo de piel anómalo que se asemeja a enfermedades cutáneas heredadas con hiperqueratosis epidérmica. 6. Método para preparar un ratón transgénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de: (a) construir y amplificar una secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, en el que dicha proteína presenta actividad de enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE), y en el que dicha secuencia de nucleótidos heteróloga está operativamente unida al promotor temprano de SV40, (b) introducir dicha secuencia de nucleótidos heteróloga en una célula de ratón, (c) usar dicha célula, o la progenie de dicha célula, para crear varios supuestos embriones de ratón o ratones transgénicos, y (d) seleccionar un ratón o embrión de ratón que tiene dicha secuencia de nucleótidos heteróloga integrada dentro de su genoma. 7. Uso del ratón transgénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, como un modelo para el estudio de enfermedad con el objetivo de mejorar el tratamiento, mitigar o mejorar un estado patogénico, para el desarrollo o las pruebas de un cosmético o una formulación farmacéutica o para el desarrollo de un método de diagnóstico en relación con enfermedad cutánea, cáncer de ovario o cáncer de piel. 8. Método para identificar un compuesto o composición eficaz para la prevención o tratamiento de un fenotipo no deseado o anómalo seleccionado de un fenotipo de piel anómalo y cáncer de piel o de ovario, comprendiendo el método (a) administrar un compuesto o composición a un ratón transgénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, (b) evaluar el fenotipo de un ratón tratado según la etapa (a), (c) comparar el fenotipo de un ratón tratado con un ratón de control no tratado e (d) identificar el compuesto o composición como eficaz para la prevención o tratamiento del fenotipo no deseado o anómalo. 9. Método según la reivindicación 8 para identificar un compuesto o composición eficaz para la prevención o tratamiento de enfermedades cutáneas heredadas con hiperqueratosis epidérmica. 10. Método según la reivindicación 8 para identificar una composición cosmética. 49     51   52   53   54     56   57