PROCEDIMIENTO DE PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS SINTÉTICAS.

Un procedimiento para separar y concentrar una molécula diana (2),

seleccionada entre oligonucleótidos sintéticos, ADN sintético y ARN sintético, que tiene un peso molecular que varía desde 0,5 hasta 5 kD a partir de una fuente de la misma que contiene adicionalmente impurezas (6a, 6b) incluyendo otras biomoléculas sintéticas que tienen un peso molecular menor que la molécula diana, que comprende las etapas de: formar una solución que contiene una mezcla de dicha molécula diana, dichas impurezas y un fluido portador; y poner en contacto la mezcla con una membrana de ultrafiltración cargada que tiene un NMWCO de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 kD, en el que la molécula diana y la membrana tienen cargas netas similares, para de ese modo separar la molécula diana de la mezcla reteniendo la molécula diana aguas arriba de la membrana mientras que las impurezas y el fluido portador pasan a través de la membrana, caracterizado porque el NMWCO de la membrana es más grande que el peso molecular de la molécula diana

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la purificación y concentración de moléculas biológicas fabricadas sintéticamente. Más particularmente, la misma se refiere a la purificación y concentración de moléculas biológicas fabricadas 5 sintéticamente, tales como oligonucleótidos, ADN sintético y ARN sintético, mediante ultrafiltración.

Las moléculas biológicas sintéticas, tales como oligonucleótidos, ADN sintético y ARN sintético se están investigando como agentes terapéuticos. Estas moléculas se usarían en lugar de moléculas naturales o recombinantes. Existen varias razones para hacer esto. Algunas moléculas simplemente no existen en la naturaleza o por alguna razón no se pueden replicar aún usando tecnologías recombinantes. La síntesis sintética puede 10 superar esta limitación. Con frecuencia, existen variantes de la misma molécula. Los sintéticos permiten preparar de forma personalizada la molécula hasta su forma deseada. Por último, los sintéticos y su fabricación con frecuencia son menos costosos de fabricar y con frecuencia evitan los problemas de riesgos biológicos de manipulación.

Estas moléculas típicamente están formadas por precursores químicos sintéticos y se ensamblan en diversos sustratos sólidos dentro de sintetizadores. 15

Después de la formación, los mismos se deben purificar y en muchos casos concentrar, bien sea para procesamiento adicional o formulación.

Las moléculas generalmente se separan de su soporte sólido y después se someten a una etapa de purificación tal como ultrafiltración o captura cromatográfica para eliminar las impurezas.

Las moléculas deseadas son relativamente pequeñas, y tienen típicamente un peso molecular desde 20 aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 kilo Dalton (kD).

Como tal, las mismas son difíciles de purificar y concentrar mediante ultrafiltración ya que con frecuencia las mismas son de aproximadamente el mismo tamaño que el poro de la membrana usada para retenerlas. Esto da como resultado la obtención de rendimientos relativamente bajos de producto. Adicionalmente, las membranas, que tienen tales tamaños de poro pequeños, sufren de flujos bajos y los tiempos de procesamiento se pueden medir en horas. 25 Esto aumenta el coste del procedimiento así como coloca una carga indebida sobre las membranas y los componentes del sistema.

Debido a esta limitación, la ultrafiltración no se acepta ampliamente para esta aplicación y se usan cromatografía, precipitación o técnicas de destilación para purificar y concentrar estas moléculas.

Estos procedimientos tienen sus propias desventajas. Los mismos están basados en biotecnología y la mayoría de 30 las veces, especialmente los procedimientos de cromatografía a escala, son más caros que la ultrafiltración. La precipitación con frecuencia introduce un agente químico adicional que necesita eliminarse. La destilación puede influir negativamente sobre las moléculas especialmente cualquiera que sea sensible al calor.

El documento WO-98/15581 divulga un procedimiento para purificar oligonucleótidos mediante ultrafiltración con membranas cargadas. La carga de la membrana se ajusta para potenciar la selectividad de la membrana. El punto 35 de corte de la membrana está por debajo del tamaño molecular de las moléculas diana.

El documento US-2003/0178368 enseña cómo potenciar la separación mediante el uso de membranas que tienen la misma carga neta incluso si el punto de corte de la membrana supera el tamaño de la molécula. Sin embargo el estudio se conduce para proteínas.

Van Reis y col (“High-performance tangential flow filtration using charged membranes”, J Mem Sci, vol. 159, Nº 1-2, 40 1999, págs. 133-142) divulgan el uso de membranas de la misma carga neta para la separación de biomoléculas.

Li S-L, y col (“Separation of I-glutamine from fermentation broth by nanofiltration” J Mem Sci, vol. 222, Nº 1-2, 2003, págs. 191-201) divulgan la separación de aminoácidos con nanofiltración.

La presente invención proporciona los medios para posibilitar la ultrafiltración en esta aplicación.

Sumario de la invención 45

Características básicas y opcionales de la presente invención se exponen en las reivindicaciones principales y secundarias respectivamente.

La presente invención hace uso de una membrana de ultrafiltración (UF) que tiene un punto de corte de peso molecular nominal (NMWCO) de desde aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 10 kD, en la que las superficies de la membrana tienen una carga que es positiva o negativa, para purificar y concentrar moléculas 50

biológicas sintéticas mediante el uso de superficies cargadas para repeler las biomoléculas sintéticas reteniéndolas en el material retenido.

La presente invención permite la eliminación de impurezas de peso molecular pequeño, reduciendo de ese modo la necesidad de cromatografía u otras etapas para conseguir niveles de purificación similares. También permite el uso de membranas con poros más grandes, aumentando de esa manera el flujo y mejorando la velocidad del 5 procedimiento y la economía y creando rendimientos de producto mayores.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un corte transversal de una membrana en uso.

La Figura 2 muestra un sistema para el procedimiento de acuerdo con la presente invención.

La Figura 3 muestra un segundo sistema para el procedimiento de la presente invención. 10

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de una o más membranas cargadas, positivas o negativas, para purificar o concentrar biomoléculas sintéticas tales como oligonucleótidos, ADN sintético y ARN sintético.

Como se ha mencionado anteriormente, el problema con la ultrafiltración en el procesamiento de biomoléculas es doble. En primer lugar, las propias moléculas son pequeñas, de 0,5 a 5 kD de tamaño. Esto requiere el uso de 15 membranas de UF muy estrechas. Incluso así, con frecuencia estas moléculas son del mismo tamaño que las aberturas en las membranas. Como resultado, con frecuencia la molécula diana pasará a través de la membrana, dando como resultado rendimientos más bajos de esa molécula. En segundo lugar, tales membranas estrechas tienen características de flujo muy bajo, lo que significa que muy poco material pasa a través de las mismas en un tiempo determinado. Esto aumenta la cantidad de tiempo necesario para procesar una cantidad dada de fluido en 20 comparación con una membrana de poro más grande. Adicionalmente, el flujo bajo puede crear contra presiones y presiones transmenbrana más elevadas sobre la membrana y el sistema, lo cual también es perjudicial.

La presente invención usa una o más membranas de UF que contienen una carga positiva o negativa.

La membrana contiene la misma carga que la molécula diana. Debido a que las cargas iguales se repelen entre sí, la membrana repele la molécula diana lejos de su superficie. Este fenómeno se puede usar como una ventaja. El 25 mismo permite el uso de una membrana con un NMWCO más elevado que la molécula diana para conseguir flujo mayor y mayor rendimiento a la vez que se aumentan los rendimientos de la molécula diana.

Las moléculas diana cargadas de forma similar se comportan como si las mismas fueran más grandes que de lo que realmente son debido a la carga que ellas y la membrana tienen. Por tanto, aunque físicamente las moléculas diana podrían pasar a través de la membrana, su carga similar evita que esto suceda. 30

Adicionalmente, las impurezas más pequeñas todavía pasan a través de la membrana aunque las mismas tienen carga similar debido a su tamaño más pequeño y la fuerza de filtración que es más grande que la fuerza de la repulsión de la carga.

La Figura 1 muestra una representación diagramática de una membrana y molécula de acuerdo con la presente invención. En esta realización, la molécula diana 2 se asume que es negativa y la superficie de la membrana 4 se 35 prepara para que tenga una carga negativa también. Las impurezas 6A y B pueden ser negativas o positivas. Como se muestra, a medida que el fluido que contiene la molécula diana pasa a través de la membrana 4 las moléculas 2 se repelen a partir de la membrana 4 debido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para separar y concentrar una molécula diana (2), seleccionada entre oligonucleótidos sintéticos, ADN sintético y ARN sintético, que tiene un peso molecular que varía desde 0,5 hasta 5 kD a partir de una fuente de la misma que contiene adicionalmente impurezas (6a, 6b) incluyendo otras biomoléculas sintéticas que tienen un peso molecular menor que la molécula diana, que comprende las etapas de: 5

formar una solución que contiene una mezcla de dicha molécula diana, dichas impurezas y un fluido portador; y

poner en contacto la mezcla con una membrana de ultrafiltración cargada que tiene un NMWCO de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 kD, en el que la molécula diana y la membrana tienen cargas netas similares, para de ese modo separar la molécula diana de la mezcla reteniendo la molécula diana aguas arriba de la membrana mientras que las impurezas y el fluido portador pasan a través de la membrana, 10

caracterizado porque el NMWCO de la membrana es más grande que el peso molecular de la molécula diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el pH de la mezcla se ajusta de forma que la molécula diana tenga una carga neta que sea la misma que la carga neta de la membrana.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la membrana tiene una carga negativa. 15

4. El procedimiento de la reivindicación 3, comprendiendo además la etapa de poner la carga negativa en la membrana mediante:

a) el ajuste del pH de dicha solución; o

b) el ajuste del pH de la fuente de la molécula diana.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la membrana tiene un NMWCO de desde aproximadamente 1,5 20 hasta aproximadamente 5 kD y la carga es una carga positiva.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, comprendiendo además la etapa de poner la carga positiva en la membrana mediante:

a) el ajuste del pH de dicha solución; o

b) el ajuste del pH de la fuente de la molécula diana. 25

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que el valor de tamizado tiene al menos una mejora de 1,5 veces en comparación con el de una membrana no cargada del mismo tipo.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente comprendiendo además hacer circular un material retenido a partir de dicha membrana a través de un bucle de recirculación de material retenido y mezclar el material retenido con la fuente de dicha molécula diana. 30

9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha mezcla se pone en contacto con una pluralidad de dichas membranas de ultrafiltración cargadas.