UN POLINUCLEÓTIDO QUE COMPRENDE UN ELEMENTO DE APERTURA DE CROMATINA UBICUO (UCOE).

Un polinucleótido que comprende un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) que no se deriva de una LCR. La presente invención también se refiere a un vector que comprende la secuencia del polinucleótido, a una célula hospedante que comprende el vector, y al uso del polinucleótido en terapia. El modelo actual de la estructura de la cromatina en eucariotas superiores postula que los genes se organizan en dominios (Dillon y Grosveld, 1994). Los dominios de cromatina pueden consistir en grupos de genes que se expresan de una manera estrictamente específica de tejido, tales como la familia de la ß-globina humana (Grosveld et al., 1993), genes que se expresan de forma ubicua, tales como el locus de TBP/C5 humano (Trachtulec, Z. et al., 1997), o una mezcla de genes específicos de tejido y expresados de forma ubicua, tales como el locus / TCR/dad- 1 murino (Hong et al., 1997; Ortiz et al., 1997) y el locus de la -globina humana (Vyas et al., 1992). Genes con dos especificidades de tejido diferentes también pueden estar muy relacionados, por ejemplo, los genes de la hormona del crecimiento y de somatomamotropina coriónica (Jones et al., 1995). Se contempla que los dominios de cromatina existen en un estado transcripcionalmente silencioso, cerrado y condensado o en una configuración transcripcionalmente competente, abierta y descondensada. El establecimiento de una estructura de cromatina abierta caracterizada por una sensibilidad a la ADNasa I, una hipometilación del ADN y una hiperacetilación de las histonas, se considera un prerrequisito para el comienzo de la expresión génica. El descubrimiento de elementos de regulación transcripcional específicos de tejido, conocidos como regiones de control de locus (LCR), ha proporcionado una nueva percepción de los mecanismos mediante los cuales se establece el dominio de cromatina abierta y transcripcionalmente competente y su mantenimiento en ciertos casos. Las LCR se definen por su capacidad para conferir a un gen unido en cis la expresión de dicho gen restringida a un tipo de célula hospedante, independiente del sitio de integración y dependiente del número de copias (Grosveld et al., 1987; Lang et al., 1988; Greaves et al., 1989; Díaz et al., 1994; Carson y Wiles, 1993; Bonifer et al., 1990; Montoliu et al., 1996; Raguz et al., 1998; docuemento EP-A-0 332 667), en especial como transgenes de una sola copia (Ellis et al., 1996; Raguz et al., 1998). Las LCR son capaces de impedir la dispersión de la heterocromatina y evitar la variegación por efecto de posición (Festenstein et al., 1996; Milot et al., 1996). Este patrón de expresión conferido por las LCR sugiere que estos elementos poseen una poderosa capacidad de remodelación de la cromatina, y también son capaces de establecer y mantener un dominio de cromatina abierta y transcripcionalmente competente. Además, se ha descubierto que las LCR poseen una capacidad de activación transcripcional inherente que les permite conferir una expresión génica específica de tejido independiente de su promotor cognado (Blom van Assendelft et al., 1989; Collis et al., 1990; Antoniou y Grosveld, 1990; Greaves et al., 1989). Todas las LCR están asociadas con dominios génicos con un marcado componente específico de tejido o restringido a tejidos, y están asociadas con una serie de sitios hipersensibles a la ADNasa I que pueden localizarse 5 (Grosveld et al., 1987; Carson y Wiles, 1993; Bonifer et al., 1994; Jones et al., 1995; Montoliu et al., 1996) o 3 (Greaves et al., 1989) de los genes que regulan. Además, en fechas recientes se ha descubierto que existen elementos LCR entre genes muy cercanos en el espacio (Hong et al., 1997; Ortiz et al., 1997). También se ha indicado que un elemento de tipo LCR tiene una localización intrónica dentre de un gen (Aronow et al., 1995). En los pocos casos que se han investigado, estos elementos se corresponden con grandes agrupaciones de sitios de unión a factores de transcripción específicos de tejido y ubicuos (Talbot et al., 1990; Philipsen et al., 1990; Pruzina et al., 1991; Lake et al., 1990; Jarman et al., 1991; Aronow et al., 1995). El descubrimiento de las LCR sugiere que los elementos reguladores que controlan la expresión de genes específicos de tejido desde un dominio de cromatina concreto están organizados de una manera jerárquica. Las LCR parecen actuar como un interruptor maestro, en donde su activación da como resultado el establecimiento de una estructura de cromatina abierta que debe preceder a cualquier expresión génica. Entonces puede lograrse la transcripción al nivel fisiológicamente requerido a través de una interacción de cromatina directa entre la LCR y el promotor local y los elementos potenciadores de un gen individual a través de la formación de bucles del ADN interviniente (Hanscombe et al., 1991; Wijgerde et al., 1995; Dillon et al., 1997). Tal como se indicó anteriormente, una característica fundamental de una LCR es su especificidad de tejido. La especificidad de tejido de una LCR ha sido investigada por Ortiz et al. (1997); se delecionó una serie de sitios hipersensibles a la ADNasa I de la LCR del receptor-alfa de células T (TCR) y se identificó un elemento derivado de LCR que abre la cromatina en una serie de tejidos. Talbot et al. (1994, NAR, 22, 756-766) describen un elemento similar a LCR que se considera que permite la expresión de un gen relacionado en una serie de tejidos. Sin embargo, no se obtuvo la expresión reproducible del gen relacionado. Se indica que los niveles de expresión tienen una desviación estándar de entre 74% del valor medio sobre una base por copia del gen, en la que el gen se expresa cuando el número de copias del transgén es de 3 o más. Cuando el número de copias es 1 ó 2, los niveles de expresión génica son 10 veces menores y tienen una desviación estándar del 49% del valor medio sobre una base por copia del gen en la que el gen se expresa. El elemento descrito por Talbot et al. no produce una expresión reproducible del gen relacionado. Esto y la alta variabilidad del sistema limita claramente el uso de este sistema. 2   La corrección a largo plazo de trastornos genéticamente heredados mediante la terapia génica requiere una expresión mantenida y sostenida de la unidad de transcripción a unos niveles lo suficientemente elevados como para que tenga valor terapéutico. Esto puede lograrse con dos estrategias. En primer lugar, las unidades de transcripción pueden integrarse de modo estable en el genoma de la célula hospedante utilizando, por ejemplo, vectores retrovíricos (Miller, 1992; Miller et al., 1993) o víricos adenoasociados (AAV) (Muzyczka, 1992; Kotin, 1994; Flotte y Carter, 1995). Como alternativa, los genes terapéuticos pueden incorporarse dentro de vectores episómicos autorreplicadores que comprenden orígenes de la replicación víricos, tales como los del EBV (Yates et al., 1985), del papovirus BK humano (De Benedetti y Rhoads, 1991; Cooper y Miron, 1993), y del BPV-1 (Piirsoo et al., 1996). Por desgracia, el nivel de expresión que se observa normalmente en genes que están integrados en el genoma es demasiado bajo o tiene una duración demasiado corta como para tener un valor terapéutico en la mayoría de los casos. Esto es debido a lo que se conoce en general como efectos de posición. La transcripción del gen introducido depende del sitio de su integración, en el que cae bajo la influencia de elementos competidores activadores (promotores/potenciadores) o, con más frecuencia, represores (silenciamiento de la cromatina). Los efectos de posición siguen imponiendo restricciones importantes a la eficacia terapéutica de los vectores con una base vírica integradores con un origen retrovírico y vírico adenoasociado (AAV). Los elementos reguladores transcripcionales víricos son muy susceptibles al silenciamiento por los elementos de cromatina cercanos a los sitios de integración. La inclusión de elementos promotores y potenciadores clásicos procedentes de genes altamente expresados como parte de las construcciones víricas no ha resuelto este importante problema (Dai et al., 1992; Lee et al., 1993). La inclusión de una LCR totalmente funcional como parte de la unidad de transcripción supera esta deficiencia puesto que este elemento puede utilizarse para conducir un nivel de expresión predecible, fisiológico y sostenido del gen deseado en un tipo celular específico (véase, Yeoman y Mellor, 1992; Brines y Klaus, 1993; Needham et al., 1992 y 1993; Tewari et al., 1998; Zhumabekov et al., 1995). Este grado de predecibilidad de la expresión es vital para una estrategia de terapia génica segura y con éxito. El uso de vectores episómicos replicadores (REV) ofrece una alternativa atractiva a los vectores víricos integradores... [Seguir leyendo]

1.- Un método para obtener un producto génico deseado que comprende cultivar una célula hospedante, en el que la célula hospedante comprende un vector, y el vector comprende un polinucleótido, comprendiendo dicho polinucleótido: (i) una isla de CpG exenta de metilación extendida que comprende promotores duales o bidireccionales que se transcriben de modo divergente, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida se extiende en más de 300 pb y comprende además un contenido medio en GC del 60%; (ii) un gen expresable que codifica un producto génico deseado, en el que el gen expresable está unido operablemente a la isla de CpG; y (iii) un promotor, unido operablemente al gen expresable, en el que el promotor no está unido operablemente en la naturaleza a la isla de CpG; en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida abre la cromatina o mantiene a la cromatina en un estado abierto y facilita la activación de la transcripción reproducible del gen expresable. 2.- El método de la reivindicación 1, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende al menos un promotor endógeno. 3.- El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende promotores duales que se transcriben de modo divergente. 4.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida se extiende en más de 500 pb. 5.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 44 kb que abarca el gen de la proteína de unión a TATA humana, y 12 kb de cada una de las secuencias flanqueantes 5 y 3. 6.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 25 kb que abarca el gen de la proteína de unión a TATA humana, con 1 kb de la secuencia flanqueante 5 y 5 kb de la secuencia flanqueante 3. 7.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende la secuencia según la figura 21 o un fragmento funcional de ésta. 8.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 60 kb que abarca el gen de la ribonucleoproteína nuclear A2 heterogénea humana, con 30 kb de la secuencia flanqueante 5 y 20 kb de la secuencia flanqueante 3. 9.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 16 kb que abarca el gen de la ribonucleoproteína nuclear A2 heterogénea humana, con 5 kb de la secuencia flanqueante 5 y 1,5 kb de la secuencia flanqueante 3. 10.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el vector comprende un promotor heterólogo que es un promotor específico de tejido o un promotor sustancialmente ubicuo. 11.- El método de la reivindicación 10, en el que el promotor es un promotor sustancialmente ubicuo y es un promotor de CMV. 12.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el gen expresable codifica un polipéptido terapéutico. 13.- El método de la reivindicación 12, en el que el gen expresable codifica un anticuerpo terapéutico o su fragmento. 14.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida aumenta la expresión del gen expresable unido operablemente. 15.- El uso de un polinucleótido aislado que comprende una isla de CpG exenta de metilación extendida para aumentar la expresión de un gen endógeno, comprendiendo dicho uso insertar el polinucleótido en el genoma de una célula en una posición operablemente asociada con el gen endógeno, aumentando con ello el nivel de expresión del gen; en el que el gen endógeno está unido operablemente a un promotor que no está unido operablemente en la naturaleza a la isla de CpG exenta de metilación extendida; 46   en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida comprende promotores duales o bidireccionales que se transcriben de modo divergente; en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida se extiende en mas de 300 pb, y comprende además un contenido medio en GC del 60%; y en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida abre la cromatina o mantiene a la cromatina en un estado abierto y facilita la activación de la transcripción reproducible del gen endógeno. 16.- Un polinucleótido que comprende: (i) una isla de CpG exenta de metilación extendida que comprende promotores duales o bidireccionales que se transcriben de modo divergente, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida se extiende en más de 300 pb y comprende además un contenido medio en GC del 60%; (ii) un gen expresable que codifica un producto génico deseado, en el que el gen expresable está unido operablemente a la isla de CpG; y (iii) un promotor, unido operablemente al gen expresable, en el que el promotor no está unido operablemente en la naturaleza a dicha isla de CpG; para su uso como un medicamento, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida abre la cromatina o mantiene a la cromatina en un estado abierto y facilita la activación de la transcripción reproducible del gen expresable. 17.- Un polinucleótido que comprende: (i) una isla de CpG exenta de metilación extendida que comprende promotores duales o bidireccionales que se transcriben de modo divergente, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida se extiende en más de 300 pb y comprende además un contenido medio en GC del 60%; (ii) un gen expresable que codifica un producto génico deseado, en el que el gen expresable está unido operablemente a la isla de CpG; y (iii) un promotor, unido operablemente al gen expresable, en el que el promotor no está unido operablemente en la naturaleza a dicha isla de CpG; para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida abre la cromatina o mantiene a la cromatina en un estado abierto y facilita la activación de la transcripción reproducible del gen expresable. 18.- Un polinucleótido aislado que comprende: (i) una isla de CpG exenta de metilación extendida que comprende promotores duales o bidireccionales que se transcriben de modo divergente, en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida se extiende en más de 300 pb y comprende además un contenido medio en GC del 60%; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo terapéutico, en el que la secuencia de nucleótidos está unida operablemente a la isla de CpG exenta de metilación extendida; y (iii) un promotor heterólogo unido operablemente a la secuencia de nucleótidos; en el que la isla de CpG exenta de metilación extendida abre la cromatina o mantiene a la cromatina en un estado abierto y facilita la activación de la transcripción reproducible de la secuencia de nucleótidos. 19.- Un vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18. 47   48   49     51   52   53   54     56   57   58   59     61   62   63   64     66   67   68   69     71   72   73   74     76   77   78   79     81   82   83   84     86   87   88   89     91   92   93   94     96   97   74 98   99     101   102   103   104     FIG. 35(A) 1 2 3 4 6 7 8 Amígdala Núcleo Cerebelo Corteza Lóbulo Hipocampo Médula A caudado cerebral frontal oblonga 161 109 99 89 118 124 Putamen Sustancia Lóbulo Tálamo Núcleo Médula B negra temporal subtalámico espinal 202 132 117 127 169 Corazón Aorta Músculo Colon Vejiga Útero Próstata Estómago C esquelético 106 177 114 293 Testículos Ovario Páncreas Glándula Glándula Glándula Glándula Glándula D pituitaria adrenal tiroides salivar mamaria 213 514 331 349 169 393 93 Riñón Hígado Intestino Bazo Timo Leucocitos Nódulo Médula E delgado periféricos linfático ósea 213 429 209 94 164 147 F Apéndice 152 Pulmón 243 Tráquea Placenta 361 Cerebro Corazón Riñón fetal Hígado Bazo Timo fetal Pulmón G fetal fetal fetal fetal fetal 137 243 149 104 H ARN total de levaduras ARNt de levaduras ARNr de E. coli ADN de E. coli poli r(A) ADN C0t 1 humano ADN humano ADN humano 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 500 ng 106   107   108   109     111   FIG. 38(A) 1 2 3 4 6 7 8 Cerebro Amígdala Núcleo Cerebelo Corteza Lóbulo Hipocampo Médula A completo caudado cerebral frontal oblonga 161 109 99 89 118 124 Lóbulo Putamen Sustancia Lóbulo Tálamo Núcleo Médula B occipital negra temporal subtalámico espinal 202 132 117 127 169 Corazón Aorta Músculo Colon Vejiga Útero Próstata Estómago C esquelético 106 177 114 293 Testículos Ovario Páncreas Glándula Glándula Glándula Glándula Glándula D pituitaria adrenal tiroides salivar mamaria 213 514 331 349 169 393 93 Riñón Hígado Intestino Bazo Timo Leucocitos Nódulo Médula E delgado periféricos linfático ósea 213 429 209 94 164 147 F Apéndice 152 Pulmón 243 Tráquea Placenta 361 Cerebro Corazón Riñón fetal Hígado Bazo Timo fetal Pulmón G fetal fetal fetal fetal fetal 137 243 149 104 ARN total ARNt de ARNr de ADN de poli r(A) ADN C0t 1 ADN ADN H de levaduras levaduras E. coli E. coli humano humano humano 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 100 ng 500 ng 112   113   114     116   117   118   119     121   122   123   124     126   127   128   129