Membrana de transferencia de wester, hidrófila, de alta unión a proteínas, con baja fluorescencia.

Una membrana porosa que comprende una membrana de sustrato polimérico,

estando dicha membrana desustrato polimérico formada por un polímero seleccionado de polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno,polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas yfluoruro de polivinilideno y caracterizada por que tiene su superficie provista de un revestimiento poliméricoreticulado hidrófilo que comprende acrilamida y metilen-bis-acrilamida y porque puede producirse a partir de unasolución de reactante que contiene del 0,20 al 2,0 % de acrilamida y del 0,20 % al 2,00 % de metilen-bis-acrilamida,y en la que:

dicha superficie tiene una capacidad de unión a proteína de 250-325 μg/cm2;

el nivel medio de carbono orgánico total de dicha membrana es inferior a 1,5 μg/cm2; y

los niveles de monómero extraíble son inferiores a 0,02 μg/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0,15 μg/cm2para la metilen-bis-acrilamida.

Membrana de transferencia de Western, hidrófila, de alta unión a proteínas, con baja fluorescencia

Antecedentes de la invención La “transferencia” o “electro-transferencia” se refiere al procedimiento usado para transferir muestras biológicas desde un gel a una membrana bajo la influencia de un campo eléctrico. El procedimiento requiere una membrana que pueda inmovilizar muestras biomoleculares para su detección posterior. Estos requisitos específicos situados sobre las membranas están relacionados con el área superficial, la porosidad y la capacidad de unión a proteínas.

La transferencia de Western es una modificación de esta técnica que implica la inmovilización de las proteínas sobre las membranas antes de la detección usando anticuerpos monoclonales o policlonales. Antes de la inmovilización de 10 las proteínas sobre la membrana, las proteínas de la muestra se separan usando electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) para separar las proteínas nativas o desnaturalizadas. Después, las proteínas se transfieren o se electro-transfieren sobre una membrana, donde se exploran y finalmente se detectan usando anticuerpos específicos contra una proteína diana. Las membranas de transferencia de Western se fabrican normalmente con nitrocelulosa (NC) o con fluoruro de polivinilideno (PVDF) . La especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno puede permitir identificar una sola proteína entre una mezcla compleja de proteínas.

Resumiendo, la transferencia de Western implica la aplicación de una muestra de proteínas (lisado) sobre un gel de poliacrilamida, la separación posterior de dicha mezcla compleja mediante electroforesis y la transferencia o “electrotransferencia” de las proteínas separadas sobre una segunda matriz, generalmente una membrana de nitrocelulosa o de fluoruro de polivinilideno (PVDF) . Después de la transferencia, la membrana se “bloquea” para impedir la unión no específica de anticuerpos a la superficie de la membrana. Los expertos en la técnica conocen muchas estrategias para marcar o etiquetar anticuerpos. En los protocolos más sencillos, las proteínas transferidas se incuban o forman complejos con un anticuerpo primario marcado con enzimas que ejerce de sonda. Después de bloquear los sitios de unión no específicos, se añade un sustrato adecuado al complejo con la enzima y conjuntamente reaccionan para formar productos cromogénicos, quimioluminiscentes o fluorogénicos detectables que permiten la detección visual,

quimioluminiscente o fluorescente, respectivamente. Los esquemas de detección más sensibles utilizan fenómenos quimioluminiscentes o fluorescentes. En una detección quimioluminiscente, un complejo enzima-sustrato produce emisiones ópticas detectables (quimioluminiscencia) . Estas emisiones se registran y se miden usando detectores adecuados, tales como dispositivos de película o fotónicos. La ausencia o presencia de señal indica si en el lisado está presente una proteína específica y la intensidad de la señal se relaciona con el nivel de la proteína de interés,

que en algunos casos puede cuantificarse.

El uso de membranas de nitrocelulosa es común en un trabajo de ensayo de inmunodetección, particularmente en la transferencia de Western. Esto se debe en parte a cuestiones históricas y a la facilidad de su uso. Las membranas de transferencia de nitrocelulosa no requieren ninguna etapa de pre-humectación con líquidos orgánicos, un requisito para trabajar con membranas hidrófobas. Las membranas hidrófobas requieren una etapa de pre35 humectación con alcohol seguida de una etapa de intercambio acuoso (para eliminar el alcohol) , antes del ensamblaje dentro del ensamblaje de transferencia-mancha. Las membranas intrínsecamente hidrófobas permiten un periodo de tiempo limitado para este ensamblaje; la capacidad de secado de la membrana es significativa. Una vez seca, la membrana no puede volver a humedecerse salvo que se repita la secuencia de pre-humectación. Una vez que la membrana está en contacto con el gel, la eliminación antes de la transferencia puede dañar realmente al

gel y a las muestras de proteínas separadas que contiene. La etapa de pre-humectación es lenta y puede bloquear considerablemente la dinámica de trabajo. Una membrana hidrófila permanecerá húmeda durante más tiempo y puede volver a humedecerse con agua si se seca antes del ensamblaje.

Las membranas de transferencia de nitrocelulosa pueden humedecerse con agua y muestran un rendimiento satisfactorio para la mayoría de las aplicaciones de transferencia. No obstante, la nitrocelulosa no es tan mecánica ni 45 químicamente estable como lo es el PVDF. El PVDF conservará su integridad mecánica durante un periodo de tiempo más largo, mientras que la NC se volverá frágil y descolorida. Las transferencias con membranas de PVDF pueden separarse de los anticuerpos y pueden volver a explorarse. Las transferencias con NC no pueden hacerlo. La NC es propensa a la oxidación atmosférica, por lo que puede volverse tóxica. Requiere una corriente residual individual y cuando se desecha debe humedecerse con un agente humectante, normalmente agua.

Las membranas de transferencia de PVDF hidrófobas poseen una capacidad de unión a proteínas equivalente a la de las membranas de transferencia de NC, pero presentan mejor rendimiento de transferencia. En las mismas condiciones, pueden detectarse concentraciones de muestra mucho más reducidas sobre estas membranas de PVDF en comparación con las de NC. Las membranas de transferencia de PVDF hidrófobas con baja fluorescencia de fondo presentan la misma detección de muestras potenciada al permitir utilizar esquemas de detección por

fluorescencia.

Los autores de la presente invención tienen en cuenta la publicación de patente internacional WO 03103814 (Millipore Corporation) que describe medios o membranas porosos con un revestimiento superficial que incluye un primer revestimiento de un terpolímero reticulado y un segundo revestimiento que comprende un copolímero o un

terpolímero modificado con un grupo funcional hidrófilo o hidrófobo con mejor combinación de propiedades, que incluyen propiedades adsortivas resistentes a biomoleculas termoestables, resistencia a soluciones muy alcalinas y bajos niveles de material extraíble.

Los autores de la presente invención también tienen en cuenta la publicación de patente de Estados Unidos 2004/007459 (Applied Materials Inc.) que describe una célula de revestimiento electroquímico que tiene una membrana permeable diferenciada por difusión multinivel situada entre un compartimento anódico y un compartimento catódico. La membrana permeable diferenciada por difusión multinivel está generalmente configurada para separar el compartimento anódico del compartimento catódico, permitiendo que una solución fluida fluya a su través en una dirección desde el compartimento anódico hacia el compartimento catódico. En una realización, una membrana permeable diferenciada por difusión multinivel comprende: una primera capa de membrana situada próxima a un ánodo de la célula de revestimiento electroquímico, siendo la primera capa de membrana una capa de disco de tipo porex; una segunda capa de membrana situada adyacente a la primera capa de membrana, siendo la segunda capa de membrana una membrana de tipo PVDF; y una tercera capa de membrana situada adyacente a la segunda capa de membrana, teniendo la tercera capa de membrana láminas y laminados de fibras. La primera capa de membrana se sitúa cerca del ensamblaje anódico, siendo la primera capa de membrana una capa Tyvek. La segunda capa de membrana se sitúa adyacente a la primera capa de membrana y es una capa de PVDF. La tercera capa de membrana se sitúa adyacente a la segunda capa de membrana y es una capa de HDPE con un espesor de aproximadamente 0, 9 mm y un tamaño de poro de entre aproximadamente 12 !m y aproximadamente 50 !m.

Los autores de la presente invención también tienen en cuenta el artículo "Polypropylene-based membrane adsorbers via photo-initiated graft copolymerization: Optimizing separation performance by preparation conditions"

(A. H. M. Yusof y M. Ulbricht) , publicado en el Journal of Membrane Science, Elsevier Scientific Publ. Company. Amsterdam, PB, vol. 311, no. 1-2, 23 de diciembre del 2007 () , páginas 294-305. El artículo describe que la preparación de membranas de separación puede realizarse de manera muy eficaz con funcionalización superficial controlada. La copolimerización fotoiniciada de injerto selectiva de superficie puede realizarse usando un procedimiento de atrapamiento por el fotoiniciador benzofenona (BP) , y usando ácido acrílico (AA) como monómero funcional... [Seguir leyendo]

1. Una membrana porosa que comprende una membrana de sustrato polimérico, estando dicha membrana de sustrato polimérico formada por un polímero seleccionado de polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno, polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas y fluoruro de polivinilideno y caracterizada por que tiene su superficie provista de un revestimiento polimérico reticulado hidrófilo que comprende acrilamida y metilen-bis-acrilamida y porque puede producirse a partir de una solución de reactante que contiene del 0, 20 al 2, 0 % de acrilamida y del 0, 20 % al 2, 00 % de metilen-bis-acrilamida, y en la que:

dicha superficie tiene una capacidad de unión a proteína d.

25. 325 !g/cm2; el nivel medio de carbono orgánico total de dicha membrana es inferior a 1, 5 !g/cm2; y los niveles de monómero extraíble son inferiores a 0, 02 !g/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0, 15 !g/cm2 para la metilen-bis-acrilamida.

2. La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, en la que dicho sustrato tiene un valor de fluorescencia de fondo, y en donde dicha membrana modificada presenta una fluorescencia de fondo que es el doble de la del valor de fluorescencia de fondo de dicho sustrato en condiciones de medida idénticas.

3. La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, en la que dicho sustrato de membrana comprende fluoruro de polivinilideno.

4. La membrana porosa de la reivindicación 1, en la que la proporción de acrilamida con respecto a metilen-bisacrilamida de la solución de reactante monomérica es de 1:1 (masa/masa) .

5. La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, en la que la concentración de monómero global de la solución de reactante monomérica de acrilamida : metilen-bis-acrilamida es entre el 0, 5 % y el 1, 5 % en masa.

6. La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, que tiene un nivel de fotoiniciador entre el 0, 01 % y el 0, 20 %.

7. Un procedimiento para preparar una membrana porosa, hidrófila, comprendiendo dicho procedimiento:

proporcionar un sustrato de membrana porosa hidrófoba formado a partir de un polímero seleccionado de polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno, polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas y fluoruro de polivinilideno; poner en contacto la superficie de dicha membrana porosa con una solución de reactante monomérica y un fotoiniciador; retirar dicha membrana de la solución de reacción; retirar la solución de reacción sobrante; polimerizar dicha solución de reactante en condiciones anaerobias directamente sobre toda la superficie de membrana porosa hidrófoba para formar un revestimiento hidrófilo continuo; y secar dicha membrana.

caracterizado por que dicha solución de reactante monomérica comprende del 0, 20 % al 2, 00 % de acrilamida y del 0, 20 % al 2, 00 % de metilen-bis-acrilamida, para formar así una membrana porosa que tiene:

una capacidad de unión a proteína de dicha superficie de 250 - 325 !g/cm2; un nivel medio de carbono orgánico total de dicha membrana inferior a 1, 5 !g/cm2; y niveles de monómero extraíble inferiores a 0, 02 !g/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0, 15 !g/cm2 para la metilen-bis-acrilamida.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que las cantidades de acrilamida y de metilen-bis-acrilamida en dicha solución de reacción son, respectivamente, del 0, 50 % y del 0, 40 %.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que la cantidad de fotoiniciador en dicha solución de reacción está comprendida entre el 0, 01 % y el 0, 20 %.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la cantidad de fotoiniciador en dicha solución de reacción es del 0, 10 %.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el fotoiniciador es Irgacure 2959 (marca registrada) .

Figura 1 Resultados de transferencias de Western del proceso R.

Los resultados corresponden a las condiciones del proceso proporcionadas en la Tabla 1. Figura 2. Resultados de transferencias de Western del proceso S

Los resultados corresponden a las condiciones del proceso proporcionadas en la Tabla 2. Figura 3 Resultados de transferencias de Western del proceso T

Los resultados corresponden a las condiciones del proceso proporcionadas en la Tabla 3