PROTEÍNAS HOMÓLOGAS DE LA QUINASA MNK IMPLICADAS EN LA REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y EN EL METABOLISMO ORGANULAR.

Utilización de una molécula de ácidos nucleicos codificante de quinasa 2 de interacción con quinasa MAP (Mnk2),

o de un polipéptido Mnk2 codificado en la misma, o de una molécula antisentido, un ribozima o una molécula de ARNi que reconoce específicamente una molécula de ácidos nucleicos de Mnk2, para el diagnóstico de la obesidad utilizando una muestra

La presente invención se refiere a la utilización de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de una quinasa 2 de interacción con la quinasa MAP (Mnk2) y secuencias de aminoácidos codificadas por las mismas, y a inhibidores de la quinasa Mnk2 en el diagnóstico y estudio de la obesidad y a la utilización de los inhibidores de la quinasa Mnk2 en la preparación de un agente destinado a la prevención o tratamiento de la obesidad. También se dan a conocer estudios referentes a enfermedades y trastornos relacionados con la regulación del peso corporal y la termogénesis, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellas, enfermedades metabólicas, así como trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardiaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer, por ejemplo cánceres de los órganos reproductivos.

Existen varias enfermedades metabólicas del metabolismo humano y animal, por ejemplo la obesidad y la pérdida severa de peso, que se relacionan con un desequilibrio energético en el que la ingesta calórica y el gasto energético se encuentran desequilibrados. La obesidad es uno de los trastornos metabólicos más prevalentes en todo el mundo. Sigue siendo una enfermedad humana todavía pobremente comprendida de creciente relevancia para la sociedad occidental. Se define la obesidad como un peso corporal más de 20% superior al peso corporal ideal, que con frecuencia resulta en una alteración significativa de la salud. Se asocia a un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular, hipertensión, diabetes, hiperlipemia y a una tasa de mortalidad incrementada. Aparte de un grave riesgo de enfermedad, el individuo que sufre de obesidad con frecuencia se encuentra aislado socialmente.

La obesidad se encuentra influida por factores genéticos, metabólicos, bioquímicos, psicológicos y de comportamiento. Por lo tanto, es un trastorno complejo que debe tratarse en varios frentes para conseguir un resultado clínico positivo duradero. Debido a que la obesidad no se considera un trastorno único, sino un grupo heterogéneo de condiciones con (potencialmente) múltiples causas, también se caracteriza por un nivel elevado de insulina plasmática en ayuno y una respuesta exagerada de insulina a la ingesta oral de glucosa (Koltermann, J. Clin. Invest. 65:1272-1284, 1980). En ocasiones se confirma una clara implicación de la obesidad en la diabetes mellitus de tipo 2 (Kopelman, Nature 404:635-643, 2000).

Los factores moleculares que resultan la ingesta de alimento y el equilibrio del peso corporal no se entienden por completo. Aunque se han descrito varios genes candidatos que se supone que influyen sobre el sistema o sistemas homeostáticos que regulan la masa/peso corporal, tales como la leptina, VCPI, VCPL o el coactivador de receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas, no se conoce cuáles son los diferentes mecanismos moleculares y/o moléculas que influyen sobre la obesidad o la regulación del peso corporal/masa corporal. Además, se han descrito varias mutaciones de un solo gen que resultan en obesidad en ratones, implicando factores genéticos en la etiología de la obesidad (Friedman y Leibel, Cell 69:217-220, 1990). En el ratón obeso, una única mutación génica (obese) resulta en una obesidad profunda, que se ve acompañada de diabetes (Friedman et al., Genomics 11:1054-1062, 1991).

El problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar un medio y método para modular condiciones metabólicas (patológicas) que influyen sobre la termogénesis, la regulación del peso corporal y/o los circuitos homeostáticos de la energía. Específicamente, se refiere al tratamiento de la obesidad. La solución al problema técnico al que se refiere la invención se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a genes con nuevas funciones en la regulación del peso corporal, la homeostasis energética, el metabolismo y la obesidad. La presente invención se refiere a un gen específico implicado en la regulación de enfermedades y trastornos relacionados con la regulación del peso corporal y específicamente la obesidad. También se dan a conocer enfermedades y trastornos relaconados con la termogénesis y las enfermedades metabólicas, así como trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardiaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares, los cánceres de los órganos reproductivos y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer. La presente memoria describe que los genes MnK humanos se encuentran implicados en las condiciones indicadas anteriormente, en particular las variantes del gen Mnk2 humano.

La expresión "número de acceso de GenBank" se refiere a las entradas en la base de datos de GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Benson et al., Nucleic Acids Res. 28:15-18, 2000).

Las proteína quinasas son moléculas importantes implicadas en la regulación de muchas funciones celulares. El gen de la serina/treonina quinasa LK6 de Drosophila melanogaster se ha descrito como una quinasa de vida corta que puede asociarse a los microtúbulos (J. Cell Sci. 110(2):209-219, 1997). El análisis genético en el desarrollo del ojo compuesto de Drosophila sugiere un papel en la modulación de la ruta de señalización de RAS (Genetics 156(3):1219-1230, 2000). Tal como se describe en la presente invención, los homólogos humanos más próximos de la quinasa LK6 de Drosophila son la quinasa 2 de interacción con la quinasa MAP (Mnk2, por ejemplo las variantes Mnk2a y Mnk2b) y la quinasa 1 de interacción con la quinasa MAP (Mnk1). La totalidad de las tres proteínas se localizan predominantemente en el citoplasma. Las Mnks son fosforiladas por las quinasas MAP pk42 Erk1 y Erk2 y las quinasas MAP p38. Esta fosforilación resulta inducida en respuesta a factores de crecimiento, ésteres de forbol y oncogenes tales como Ras y Mos, así como moléculas de señalización de estrés y citoquinas. La fosforilación de las proteínas Mnk estimula su actividad de quinasa del factor 4E de inicio eucariótico (EMBO J. 16:1909-1920, 1997, Mol. Cell Biol. 19:1871-1880, 1999, Mol Cell Biol. 21:743-754, 2001). La fosforilación del factor de inicio eucariótico 4E (elF4E) resulta en la regulación de la traducción en proteínas (Mol. Cell Biol. 22:5500-5511, 2001).

Existen diferentes hipótesis que describen el modo de estimulación de la traducción en proteínas por parte de las proteínas Mnk. La mayoría de publicaciones describe un efecto estimulador positivo sobre la traducción de proteínas dependiente de cap tras la activación de las quinasas de interacción con MAP quinasas. De esta manera, la activación de las proteínas Mnk podría conducir a una estimulación o regulación indirecta de la traducción en proteínas, por ejemplo mediante la acción de la fosfolipasa 2 alfa citosólica (BBA 1488:124-138, 2000).

Se han descrito inhibidores de Mnk (denominados CGP57380 y CGP052088) en la técnica anterior (ver Knauf et al., Mol. Cell. Biol. 21:5500, 2001; Tschopp et al., Mol. Cell Biol. Res. Comm. 3:205, y Slentz-Kesler et al., Genomics 69:63, 2000). CGP052088 es un derivado de estaurosporina con una IC50 de 70 nM para la inhibición de la actividad in vitro de quinasa de Mnk1. CGP57380 es un inhibidor no citotóxico de bajo peso molecular selectivo de Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b) o de Mnk1. La adición de CGP57380 células en cultivo transfectadas con Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b)

o con Mnk1 resultó en una fuerte reducción del eIF4E fosforilado.

Hasta el momento no se ha descrito que las quinasas Mnk se encuentren implicadas en la regulación del peso corporal y la termogénesis, y de esta manera podrían encontrarse asociadas a enfermedades metabólicas, tales como la obesidad, así como a trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardiaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos... [Seguir leyendo]

1. Utilización de una molécula de ácidos nucleicos codificante de quinasa 2 de interacción con quinasa MAP (Mnk2), o de un polipéptido Mnk2 codificado en la misma, o de una molécula antisentido, un ribozima o una molécula de ARNi que reconoce específicamente una molécula de ácidos nucleicos de Mnk2, para el diagnóstico de la obesidad utilizando una muestra.

2. Utilización de una composición farmacéutica que comprende una molécula antisentido, un ribozima o una molécula de ARNi que reconoce específicamente una molécula de ácidos nucleicos de Mnk2 conjuntamente con portadores, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un agente destinado al tratamiento de la obesidad.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la molécula de ácidos nucleicos es un ácido nucleico de Mnk2 de vertebrado o de insecto, particularmetn un ácido nucleico de Mnk2 humana, particularmente un ácido nucleico codificante del gen homólogo de Mnk en el cromosoma humano 19 denominado Mnk2 (nº de acceso GenBank XM_030637, idéntico al nº de acceso GenBank AF237775.1 y/o el número de acceso GenBank NM_017572.1).

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de ácidos nucleicos codificante de Mnk2:

(a) se hibrida a 50ºC en una solución que contiene 1 x SSC y SDS al 0,1% con un ácido nucleico de Mnk2

o la cadena complementaria del mismo, particularmente una molécula de ácidos nucleicos codificante de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos Mnk2 mostrados en la figura 3E ó 3G,

(b) es degenerado respecto a la molécula de ácidos nucleicos de (a),

(c) codifica un polipéptido Mnk2 que es por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 98%, y hasta 99,6% idéntico a los polipéptidos mostrados en la figura 3E ó 3G,

(d) difiere de la molécula de ácidos nucleicos de (a) a (c) por mutación, y en la que dicha mutación causa una alteración, deleción, duplicación o parada prematura en el polipéptido codificado.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la molécula de ácidos nucleicos es una molécula de ADN, particularmente un ADNc o un ADN genómico.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha molécula de ácidos nucleicos es una molécula de ácidos nucleicos recombinante.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la molécula de ácidos nucleicos es un vector, particularmente un vector de expresión.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polipéptido es un polipéptido recombinante.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho polipéptido recombinante es un polipéptido de fusión.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha molécula de ácidos nucleicos se selecciona de entre sondas de hibridación, cebadores y oligonucleótidos antisentido.

11. Utilización de un animal transgénico no humano que muestra una expresión modificada de un polipéptido Mnk2 en estudios funcionales sobre la obesidad o para el cribado de fármacos para la obesidad.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que la expresión del polipéptido Mnk2 se encuentra incrementada y/o reducida.

13. Utilización de una célula huésped recombinante que muestra una expresión modificada de un polipéptido Mnk2 en estudios funcionales sobre la obesidad o para el cribado de fármacos para la obesidad.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que la célula es una célula humana.

15. Método para identificar un (poli)péptido implicado en la obesidad en un mamífero, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una colección de (poli)péptidos con un polipéptido Mnk2 o un fragmento catalítico del mismo bajo condiciones que permiten la unión de dichos (poli)péptidos,

(b) eliminar (poli)péptidos que no se unen, y

(c) identificar (poli)péptidos que se unen a dicho polipéptido Mnk2.

16. Método de cribado de un agente que resulta adecuado para el tratamiento de la obesidad en un mamífero mediante la modulación de la interacción del polipéptido mnk2 con una diana/agente de unión, que comprende las etapas de:

(a) incubar una mezcla que comprende: (aa) un polipéptido Mnk2, o un fragmento catalítico del mismo, (ab) una diana/agente de unión de dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo, y (ac) un agente candidato

bajo condiciones en las que dicho polipéptido Mnk2 se une específicamente a dicha diana/agente de unión con una afinidad de referencia,

(b) detectar la afinidad de unión de dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo a dicha diana de unión con el fin de determinar una afinidad basada en el agente (candidato), y

(c) determinar una diferencia entre la afinidad basada en el agente (candidato) y la afinidad de referencia.

17. Método de cribado de un agente que resulta adecuado para el tratamiento de la obesidad en un mamífero mediante la modulación de la actividad de un polipéptido Mnk2, que comprende las etapas de:

(a) incubar una mezcla que comprende: (aa) un polipéptido Mnk2 o un fragmento catalítico del mismo, (ab) un agente candidato,

bajo condiciones en las que dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo muestra una actividad de referencia,

(b) detectar la actividad de dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo con el fin de determinar una actividad basada en el agente (candidato), y

(c) determinar una diferencia entre una actividad basada en el agente (candidato) y la actividad de referencia.

18. Método según la reivindicación 16 ó 17, en el que el agente candidato se selecciona de entre péptidos y compuestos orgánicos de bajo peso molecular.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que se utiliza un inhibidor o activador de Mnk2 conocido a modo de control positivo para el desarrollo de un ensayo y/o la validación de agentes candidatos.

20. Utilización de N3-(4-fluorofenil)-1H-pirazol[3,4-d]pirimidín-3,4-diamina (CGP573809 para la preparación de un agente destinado al tratamiento de la obesidad.

21. Utilización de N3-(4-fluorofenil)-1H-pirazol[3,4-d]pirimidín-3,4-diamina (CGP57380) para el diagnóstico de la obesidad utilizando una muestra.