Una proteína neumoprotectora (PPP) aislada asociada a la superficie de S.

pneumoniae que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 5 y 10-19, o un fragmento de la misma, en la que dicha PPP o fragmento de la misma tiene la capacidad de reducir la colonización de bacterias neumocócicas y retiene la función biológica de la interacción con hierro

campo de la invención

La presente invención proporciona secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos referentes a una proteína de Streptococcus pneumoniae que tiene un peso molecular de 20 kilodalton (kDa). La presente invención también se refiere a composiciones para el tratamiento y la profilaxis de infección o inflamación asociada a infección bacteriana.

Antecedentes de la invención

El oído medio es una cavidad llena de aire estéril separada del oído externo por la membrana del tímpano. Unida a la membrana del tímpano hay tres huesecillos del oído que vibran cuando las ondas del sonido golpean la membrana del tímpano. Las vibraciones se transmiten al oído interno, que genera impulsos nerviosos que son enviados al cerebro. El aire puede entrar en el oído medio por la trompa de Eustaquio, que se abre en las paredes de la nasofaringe.

La nasofaringe está localizada posterior a las fosas nasales. La nasofaringe está revestida de epitelio respiratorio y epitelio escamoso estratificado. Debajo del epitelio respiratorio, el abundante tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT) forma la amígdala nasofaríngea (adenoides).

La infección o inflamación bacteriana del oído medio se observa principalmente en niños. Debido al aislamiento del oído medio, se sugiere que el desarrollo de infecciones del oído medio requiere la participación de la nasofaringe y la trompa de Eustaquio. Las infecciones por Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) son una de las causas principales de infecciones del oído medio, además de bacteriemia, meningitis y neumonía mortal en todo el mundo (Butler, J.C. y col., American Journal of Medicine, 1999, 107:69S-76S). La rápida aparición de cepas neumocócicas multirresistentes en todo el mundo ha conducido al aumento del énfasis en la prevención de infecciones neumocócicas por vacunación (Goldstein y Garau, Lancet, 1997, 350:233-4).

Los antígenos de la proteína de S. pneumoniae se han evaluado para la eficacia protectora en modelos animales de infección neumocócica. Algunos de los candidatos a vacuna más comúnmente estudiados incluyen las proteínas PspA, lipoproteína PsaA y la proteína CbpA. Numerosos estudios han mostrado que la proteína PspA es un factor de virulencia (Crain, M.J. y col., Infect Immun, 1990, 58:3293-9; McDaniel, L.S. y col., J Exp Med, 1984, 160:386-97), pero es antigénicamente variable entre cepas neumocócicas. Adicionalmente, un estudio reciente ha indicado que algunas regiones antigénicamente conservadas de una variante recombinante de PspA pueden provocar anticuerpos de reactividad cruzada en adultos humanos (Nabors, G.S. y col., Vaccine, 2000, 18:1743-1754). La PsaA, una lipoproteína de 37 kDa con similitud con otras adhesinas Gram-positivas, participa en el transporte de manganeso en neumococos (Dintilhac, A. y col., Molecular Microbiology, 1997, 25(4):727-739; Sampson, J.S. y col., Infect Immun, 1994, 62:319-24) y se ha mostrado que es protectora en modelos de ratón de enfermedad sistémica (Talkington, D.F. y col., Microb Patog, 1996. 21:17-22). La proteína de unión a colina expuesta en la superficie, CbpA, está antigénicamente conservada y también es protectora en modelos de ratón de enfermedad neumocócica (Rosenow, C. y col. Molecular Microbiology, 1997, 25:819-29). Como la colonización nasofaríngea es un requisito previo para la enfermedad ótica, la inmunización intranasal de ratones con proteínas neumocócicas y adyuvantes de la mucosa apropiados se ha usado para potenciar la respuesta de anticuerpos de la mucosa y, por tanto, la eficacia de candidatos a vacunas de proteína (Briles, D.E. y col., Infect Immun, 2000, 68:796-800; Yamamoto, M. y col., A. J Immunol, 1998, 161:4115-21).

La vacuna de polisacáridos capsulares neumocócicos 23-valente actualmente disponible no es eficaz en niños de menos de 2 años de edad o en pacientes inmunodeprimidos, dos de las principales poblaciones en riesgo de infección neumocócica (Douglas, R.M. y col., Journal of Infectious Diseases, 1983, 148:131-137). Se mostró que una vacuna de conjugado de polisacárido-proteína neumocócico 7-valente era altamente eficaz en bebés y niños contra enfermedad neumocócica sistémica producida por los serotipos de vacuna y contra serotipos capsulares de reactividad cruzada (Shinefield y Black, Pediatr Infect Dis J, 2000, 19:394-7). Los siete tipos capsulares cubren más del 80% de las cepas aisladas de enfermedad en los Estados Unidos, pero sólo el 57-60% de las cepas aisladas de enfermedad en otras áreas del mundo (Hausdorff, W.P. y col., Clinical Infectious Diseases, 2000, 30:100-21). Por tanto, hay una necesidad inmediata de una vacuna que cubra la mayoría o todos los serotipos que producen enfermedad de neumococos.

El hierro es un elemento esencial para la colonización e infección por muchas bacterias patogénicas. La prevención del proceso de adquisición debería producir una reducción de la colonización y un menor potencial de enfermedad. Los complejos de adquisición de hierro en patógenos satisfactorios tales como, pero no se limitan a, N. gonorrhoeae,

N. meningitidis, M. catarrhalis y H. influenzae han sido evaluados para su potencial de vacuna por otros laboratorios (Conte, M.P. y col., Infection and Immunity, 1999, 64:3925; Gray-Owens, S.D. y col. Infection and Immunity, 1995, 64:1201; Luke N.R. y col., Infection and Immunity, 1999, 67:681; Pettersson, A. y col., Infection and Immunity, 1993,

61: 4724). Por tanto, el aislamiento de las estructuras responsables de la adquisición de hierro podría conducir a candidatos a vacuna.

Previamente se ha descrito la prevención de la colonización de S. pneumoniae como estrategia en la prevención de infecciones. Se han descrito diferentes proteínas asociadas a la superficie que participan en la unión de la bacteria de la superficie de la mucosa en el tracto respiratorio superior. En particular, Briles y col. (Vaccine, Butterworth Scientific. Guildford, GB, volumen 19, 8 de diciembre de 2000, páginas S87-S95) describen que la proteína PspA tiene eficacia contra otitis media en animales. Briles y col., (Vaccine, Butterworth Scientific. Guildford, GB, volumen 18, 16 de febrero de 2000, páginas 1707-1711) muestran varias proteínas neumocócicas que provocan la protección en ratones que incluyen PspA, neumolisina, PsaA y PspC. Hammerschmidt Sven y col., (Infection and Immunity, volumen 67, no 4, abril de 1999, páginas 1683-1687) describen que la PspA actúa de proteína de unión a lactoferrina humana y sugiere que la S. pneumoniae puede usar la interacción lactoferrina humana-PspA para vencer la limitación del hierro en las superficies de la mucosa debido a la presencia de lactoferrina, representando quizás un posible mecanismo de virulencia. Finalmente, Gosink Khoosheh K y col., (Infection and Immunity, volumen 68, no 10, octubre de 2000, páginas 590-5695) describen varias proteínas de unión a colina, algunas de las cuales se encontró que participaban en la colonización de S. pneumoniae.

Resumen de la invención

La presente invención contempla una proteína neumoprotectora (PPP) aislada asociada a la superficie de S. pneumoniae que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 5 y 10-19, o un fragmento de la misma; teniendo la PPP o fragmento de la misma la capacidad de reducir la colonización de bacterias neumocócicas.

La presente invención contempla una PPP recombinante asociada a la superficie de S. pneumoniae que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 5 y 10-19, o un fragmento de la misma; teniendo la PPP o fragmento de la misma la capacidad para reducir la colonización de bacterias neumocócicas y retener la función biológica de la interacción con hierro.

La presente invención contempla una PPP recombinante asociada a la superficie de S. pneumoniae que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 5 y 10-19, o un fragmento de la misma; teniendo la PPP o fragmento de la misma la capacidad para reducir la colonización de bacterias neumocócicas y retener la función biológica de la interacción con hierro; en la que la PPP tiene un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,587.

La presente invención contempla una PPP recombinante asociada a la superficie de S. pneumoniae que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 5 y 10-19, o un fragmento de la misma; teniendo la PPP o fragmento de la misma la capacidad para reducir la colonización de bacterias neumocócicas y retener la función biológica de la interacción con hierro, en la que la PPP tiene un... [Seguir leyendo]

1. Una proteína neumoprotectora (PPP) aislada asociada a la superficie de S. pneumoniae que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 5 y 10-19, o un fragmento de la misma, en la que dicha PPP o fragmento de la misma tiene la capacidad de reducir la colonización de bacterias neumocócicas y retiene la función biológica de la interacción con hierro.

2. Una PPP o fragmento de la misma como se define en la reivindicación 1, en la que dicha PPP o fragmento de la misma es una proteína recombinante.

3. Una PPP o fragmento de la misma como se define en la reivindicación 2, teniendo dicha PPP un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,587.

4. Una PPP o fragmento de la misma como se define en la reivindicación 3, teniendo dicha PPP una carga de aproximadamente 14,214 a pH 7.

5. Una PPP o fragmento de la misma como se define en la reivindicación 1, teniendo dicha PPP una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 5, o un fragmento de la misma.

6. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una PPP o un fragmento de la misma como se define en la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos tiene una secuencia como se representa en SEC ID Nº: 4, o un fragmento de la misma.

7. Un ácido nucleico como se define en la reivindicación 6 que es un ADNc.

8. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una PPP o fragmento de la misma como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 6, en la que dicha secuencia está operativamente asociada a una secuencia de control de la expresión.

9. Una célula huésped transfectada con el vector como se define en la reivindicación 8.

10. Un procedimiento para producir PPP recombinante o fragmento de la misma, procedimiento que comprende aislar dicha PPP o fragmento de la misma producido por las células huésped como se define en la reivindicación 9, en el que las células huésped se han cultivado en condiciones que proporcionan la expresión de dicha PPP o fragmento de la misma por dicho vector.

11. Una composición que comprende una PPP o fragmento de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una PPP o fragmento de la misma como se define en la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición que comprende el vector de expresión como se define en la reivindicación 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición que comprende la célula huésped como se define en la reivindicación 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición inmunogénica que comprende (i) una PPP asociada a la superficie de S. pneumoniae o fragmento de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, y (iii) opcionalmente al menos un adyuvante.

16. Una composición como se define en la reivindicación 15, teniendo dicha PPP o fragmento de la misma codificado por una secuencia de ácidos nucleicos una secuencia como se representa en SEC ID Nº: 4, o un fragmento inmunogénico de la misma.

17. Una composición inmunogénica que comprende (i) al menos un vector de expresión según la reivindicación 8; (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable; y (iii) opcionalmente al menos un adyuvante.

18. Una composición como se define en la reivindicación 17, en la que dicha bacteria neumocócica es Streptococcus pneumoniae.

19. Una composición como se define en la reivindicación 15, 16 ó 18, en la que dicha composición provoca inmunidad protectora de una enfermedad producida por Streptococcus pneumoniae.

20. Una composición como se define en la reivindicación 19, en la que dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en otitis media, rinosinusitis, bacteriemia, meningitis, neumonía e infección del tracto respiratorio inferior.

21. Uso, en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero, de una composición como se define en la reivindicación 15 ó 17.

22. Uso, en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que está infectado por bacterias neumocócicas, de un compuesto eficaz para inhibir la unión de una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 5 para inducir dicha respuesta inmunitaria en dicho mamífero.

23. Un procedimiento para cribar un compuesto que induce una respuesta inmunitaria en un mamífero infectado por bacterias neumocócicas, comprendiendo dicho procedimiento comparar una primera cantidad de unión de una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 5 en presencia de dicho compuesto con una segunda cantidad de unión de una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 5 en ausencia de dicho compuesto; por lo que una primera cantidad de unión más baja que dicha segunda cantidad de unión indica que dicho compuesto puede inducir dicha respuesta inmunitaria en dicho mamífero.

24. Un procedimiento in vitro para diagnosticar infección bacteriana neumocócica, comprendiendo dicho procedimiento comparar el nivel de PPP como se representa en SEC ID Nº: 5, o fragmentos de la misma, en una muestra de la que se sospecha con el nivel de PPP como se representa en SEC ID Nº: 5, o fragmentos de la misma, en una muestra de control, por lo que un nivel de dicha proteína neumoprotectora en dicha muestra sospechosa superior al nivel de dicha proteína neumoprotectora en dicha muestra de control indica que dicha muestra sospechosa comprende infección bacteriana neumocócica; en el que dicha PPP o fragmento de la misma tiene la capacidad de reducir la colonización de bacterias neumocócicas y retiene la función biológica de la interacción con hierro.

25. Un anticuerpo que reconoce selectivamente una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID Nº: 5, o un fragmento de la misma.

26. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 25, que es quimérico.

27. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 25, que es un anticuerpo monoclonal.

28. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 25 ó 27, que es humanizado.

29. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 25 ó 27, que es antiidiotípico.

30. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 25 ó 27, que está conjugado con un compuesto farmacéuticamente activo.

31. Uso, en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria contra infección neumocócica en un mamífero, de un anticuerpo como se define en la reivindicación 29.

32. Uso, en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero infectado por bacterias neumocócicas, de un anticuerpo como se define en la reivindicación 30.