PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION O PRODUCCION DE UNA PROTEINA MAGE.

Un procedimiento para la purificación o producción de una proteína MAGE,

que comprende reducir los enlaces disulfuro de la proteína y bloquear el grupo tiol libre resultante con un grupo bloqueante y que comprende además una o más etapas cromatográficas, en el que la proteína se solubiliza usando un agente caotrópico fuerte o un agente zwitteriónico

Procedimiento de purificación o producción de una proteína MAGE.

La presente invención se refiere a procedimientos para purificar o producir una proteína MAGE. La presente divulgación se refiere a derivados de proteína que comprenden un antígeno asociado a tumores, que encuentran utilidad en la terapia de vacunas para cánceres. En particular, los derivados de la divulgación incluyen proteínas de fusión que comprenden un antígeno codificado por la familia de genes MAGE (por ejemplo, MAGE-3, MAGE-1), unido a un compañero de fusión inmunológico que proporciona epítopes T auxiliares, tales como, por ejemplo, la forma lipidada de la proteína D de Haemophilus influenzae B; proteínas MAGE modificadas químicamente en las que los puentes disulfuro del antígeno están reducidos y los tioles resultantes bloqueados y las proteínas MAGE modificadas genéticamente proporcionadas con un marcador de afinidad y/o modificadas genéticamente para prevenir la formación de puentes disulfuro. También se describen procedimientos para formular vacunas para tratar una serie de cánceres, que incluyen, pero sin limitación Melanoma, carcinoma de mama, vejiga, pulmón, NSCLC, de cabeza y de células escamosas, carcinoma de colon y carcinoma esofágico.

Los antígenos codificados por la familia de genes MAGE se expresan predominantemente en células de melanoma (incluyendo melanoma maligno) y algunos otros cánceres que incluyen NSCLC (cáncer no microcítico de pulmón), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células transicionales de vejiga y carcinoma esofágico, pero no son detectables en tejidos normales excepto en los testículos y en la placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 se expresa en el 69% de los melanomas (Gaugler, 1994) y también puede detectarse en el 44% de NSCLC (Yoshimatsu 1988), en el 48% de los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, en el 34% de carcinomas de células transicionales de vejiga, en el 57% de carcinoma esofágico, en el 32% de cánceres de colon y en el 24% de cánceres de mama (Van Pel, 1995); Inoue, 1995 Fujie 1997; Nishimura 1997). Los cánceres que expresan proteína MAGE se conocen como tumores asociados a Mage.

La inmunogenicidad de células de melanoma humano se ha demostrado elegantemente en experimentos usando cultivos mixtos de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos cultivos con frecuencia generan linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos capaces de lisar exclusivamente las células de melanoma autólogas pero ni los fibroblastos autólogos ni los linfocitos B transformados por EBV autólogos (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Ahora se han identificado varios de los antígenos reconocidos en células de melanoma autólogas por estos clones de CTL, incluyendo los de la familia MAGE.

El primer antígeno que podría definirse por medio de su reconocimiento por CTL específicos en células de melanoma autólogas se denomina MZ2-E (Van den Eynde, 1989) y se codifica por el gen MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). Los CTL dirigidos contra MZ2-E reconocen y lisan células de melanoma positivas para MZ2-E de pacientes autólogos así como de otros pacientes siempre que estas células tengan el alelo HLA.A1.

El gen MAGE-1 pertenece a una familia de 12 genes estrechamente relacionados, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, localizados en el cromosoma X y que comparten entre sí una homología del 64 al 85% en su secuencia codificante (De Plaen, 1994). Algunas veces éstos se conocen como MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12 (La familia MAGE A). También forman parte de la familia MAGE otros dos grupos de proteínas aunque están relacionados de forma más distante. Estos son los grupos MAGE B y MAGE C. La familia MAGE B incluye MAGE B1 (también conocido como MAGE Xp1 y DAM 10), MAGE B2 (también conocido como MAGE Xp2 y DAM 16) MAGE B3 y MAGE B4 - la familia Mage C actualmente incluye MAGE C1 y MAGE C2. En términos generales, una proteína MAGE puede definirse como una proteína que contiene una firma de secuencia central localizada hacia el extremo C terminal de la proteína (por ejemplo con respecto a MAGE A1, una proteína de 309 aminoácidos, la firma central corresponde a los aminoácidos 195-279).

Por lo tanto, el patrón consenso de la firma central se describe como se indica a continuación en el que x representa cualquier aminoácido, los restos en letra minúscula están conservados (se permiten variantes conservativas) y los restos en letras mayúsculas están perfectamente conservados. Firma de secuencia central

LixvL (2x) I (3x) g (2x) apEExiWexl (2x)m(3-4x) Gxe (3-4x) gxp (2x) llt (3x) VqexYLxYxqVPxsxP (2x)yeFLWGprA (2x) Et (3 x) kv

Las sustituciones conservativas son bien conocidas y generalmente se establecen como las matrices de puntuación por defecto en programas informáticos de alineación de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft M.O. y col., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", en "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

En términos generales, la sustitución dentro los siguientes grupos son sustituciones conservativas, pero las sustituciones entre grupos se consideran no conservadas. Los grupos son:

En general y en el contexto de esta invención, una proteína MAGE contendrá aproximadamente una identidad del 50% en esta región central con los aminoácidos 195 a 279 de MAGE A1.

Se han identificado varios epítopes de CFT en la proteína MAGE-3. Uno de estos epítopes, MAGE-3.A1 es una secuencia nonapeptídica localizada entre los aminoácidos 168 y 176 de la proteína MAGE-3 que constituye un epítopo específico para los CTL cuando se presenta en asociación con la molécula del CMH de clase I HLA.A1. Recientemente se han identificado dos epítopes de CTL adicionales en la secuencia peptídica de la proteína MAGE-3 por su capacidad de crear una respuesta de CTL en un cultivo mixto de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos dos epítopes tienen motivos de unión específicos para los alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) y HLA.B44 (Herman, 1996) respectivamente.

Carrel y col. (1996) International Journal of Cancer 67(3), 417-422 desvelan la identificación de un antígeno de 72 kDa de reacción cruzada que se coexpresa con la proteína MAGE-1 en células de melanoma.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la purificación o producción de una proteína MAGE, que comprende reducir los enlaces disulfuro de la proteína y bloquear el grupo tiol libre resultante con un grupo bloqueante y que comprende además una o más etapas cromatográficas, en las que la proteína se solubiliza usando un agente caotrópico fuerte o un detergente zwitteriónico.

La presente divulgación proporciona derivados de la proteína MAGE. Estos derivados son adecuados para uso en formulaciones de vacuna terapéutica que son adecuadas para el tratamiento de una serie de tipos de tumores.

En una realización de la presente divulgación, el derivado es una proteína de fusión que comprende un antígeno de la familia de proteínas MAGE unido a un compañero heterólogo. Las proteínas pueden estar conjugadas químicamente, pero preferentemente se expresan como proteína de fusión recombinantes que permiten producir mayores niveles en un sistema de expresión en comparación con una proteína no fusionada. De esta manera, el compañero de fusión puede ayudar a proporcionar epítopes T auxiliares (compañero de fusión inmunológico), preferentemente epítopes T auxiliares reconocidos por seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de la expresión) a mayores rendimientos que la proteína...

1. Un procedimiento para la purificación o producción de una proteína MAGE, que comprende reducir los enlaces disulfuro de la proteína y bloquear el grupo tiol libre resultante con un grupo bloqueante y que comprende además una o más etapas cromatográficas, en el que la proteína se solubiliza usando un agente caotrópico fuerte o un agente zwitteriónico.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente caotrópico es urea o clorhidrato de guanidinio.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el detergente zwitteriónico es Empigen BB-n-dodecil-N,N-dimetilglicina.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el agente bloqueante es un agente alquilante.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el agente bloqueante es un alfa haloácido y/o alfa haloamida.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que el agente bloqueante es uno o más de los siguientes: ácido yodoacético; yodoacetamida; N-etilmaleimida; cloroacetil fosfato; O-metilisourea; y acrilonitrilo.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína comprende un marcador de afinidad.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el marcador de afinidad es CLytA o una cola de polihistidina.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la proteína que comprende un marcador de afinidad, después de la etapa de bloqueo, se somete a cromatografía de afinidad.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la cromatografía de afinidad es una cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC).

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el ión metálico se selecciona entre los siguientes: cinc, níquel, hierro, magnesio o cobre.

12. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones, 9, 10 u 11, en el que la cromatografía de afinidad se realiza usando tampón que contiene el detergente zwiteriónico Empigen BB.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína es una proteína de fusión que comprende un antígeno MAGE y un compañero de fusión.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el compañero de fusión es proteína D o un fragmento de la misma procedente de Haemophilus influenzae B que comprende el primer 1/3 de la proteína D, la proteína NS1 del virus de la gripe o un fragmento de la misma que comprende los 81 aminoácidos N terminales de NS1, o LytA de Streptococcus pneumonia o un fragmento de la misma que comprende los restos 188-305 de LytA.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el compañero de fusión es la forma lipidada de la proteína D.

16. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que la proteína comprende LytA o un fragmento de la misma que comprende los restos 188-305 y en el que la proteína se purifica por cromatografía de afinidad a colina o análogos de colina tales como DEAE.

17. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el antígeno MAGE se selecciona entre el grupo MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3 y MAGE B4, MAGE C1, MAGE C2.

18. Un procedimiento para la producción de una vacuna, que comprende las etapas de producir o purificar una proteína MAGE, por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y formular la proteína resultante como una vacuna.