Un procedimiento para producir una vesícula lipídica que encapsula un producto terapéutico,

comprendiendo dicho procedimiento: proporcionar una solución acuosa en un primer depósito; proporcionar una solución lipídica orgánica en un segundo depósito, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico; mezclar dicha solución acuosa con dicha solución lipídica orgánica, mezclándose dicha solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa de modo que se produzca de forma sustancialmente instantánea una vesícula lipídica que encapsula el producto terapéutico; caracterizado porque la mezcla incluye introducir la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en un ambiente de mezcla a caudales sustancialmente iguales y el ambiente de mezcla incluye un conector T, introduciéndose la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí

Procedimiento y aparato para producir liposomas.

Antecedentes de la invención

Se conocen ya muchos sistemas para administrar sustancias activas, tales como liposomas, nanopartículas, partículas poliméricas, inmunocomplejos y complejos de ligando y ciclodextrinas (véase, Drug Transport in antimicrobial and anticancer chemotherapy. G. Papadakou Ed., CRC Press, 1995). Los liposomas se preparan típicamente en el laboratorio mediante sonicación, diálisis con detergente, inyección de etanol o dilución, extrusión con prensa francesa, infusión de éter y evaporación de fase inversa. Los liposomas con múltiples bicapas se conocen como vesículas lipídicas multilamelares (MLV). Las MLV son candidatos para fármacos de liberación temporal debido a que los fluidos atrapados entre las capas solo se liberan a medida que se degrada cada membrana. Los liposomas con una bicapa única se conocen como vesículas lipídicas unilamelares (UV). Las UV pueden preparase pequeñas (SUV) o grandes (LUV).

Algunos de los procedimientos anteriores para la producción de liposomas imponen condiciones severas o extremas que pueden dar como resultado la desnaturalización del material fosfolipídico sin tratar y fármacos encapsulados. Además, estos procedimientos no pueden escalarse fácilmente para una producción en masa de grandes volúmenes de liposomas. Además, la formación de vesículas lipídicas por dilución convencional con etanol, implica la inyección o adición en gotas de un lípido en un tampón acuoso. Las vesículas resultantes son típicamente heterogéneas en tamaño y contienen una mezcla de vesículas unilamelares y multilamelares.

Los liposomas convencionales se formulan para portar agentes terapéuticos contenidos dentro del espacio interior acuoso (fármacos solubles en agua) o repartidos en la capa o capas lipídicas (fármacos insolubles en agua). Los agentes activos que tienen semividas cortas en el torrente sanguíneo son particularmente adecuados para su suministro mediante liposomas. Se sabe que muchos agentes antineoplásicos, por ejemplo, tienen una semivida corta en el torrente sanguíneo de modo que su uso parenteral no es viable. Sin embargo, el uso de liposomas para suministro específico de sitio de agentes activos mediante el torrente sanguíneo está limitado gravemente por el rápido aclaramiento de liposomas de la sangre por células del sistema reticuloendotelial (SRE).

El documento EP-A-1 203 614 desvela técnicas para la preparación de vesículas lipídicas usando un aparato que tiene un primer conducto (fase lipídica) conectado a un segundo conducto (fase polar) de modo que las porciones exteriores de los conductos forman una superficie de contacto común (orificio). El orificio se dispone de modo que la fase lipídica pueda pasar de forma sustancialmente perpendicular a la dirección del flujo de la fase polar.

El documento WO 02/43699 desvela un procedimiento para preparar liposomas grandes (es decir, de 1 a 8 micrómetros de tamaño) que contienen una sustancia farmacéutica atrapada por infusión de una solución de alcohol que contiene lípidos directamente en una solución de polímero acuoso, tal como una solución de polietilenglicol (PEG).

El documento EP-A-1 013 268 desvela un procedimiento para producir liposomas o emulsiones mediante pulverización de una solución oleosa y una solución acuosa en una boquilla de mezcla, en la que los liposomas o emulsiones se forman en la bruma cuando las soluciones nebulizadas colisionan entre sí.

El documento WO 00/29103 desvela un procedimiento para preparar liposomas en el que las fases lipídica y acuosa se introducen en una cámara de premezcla con una alta velocidad a 90º entre sí, creando de este modo un flujo turbulento. De hecho, el premezclador se diseña para crear un vórtice turbulento mediante el cual una corriente de componente se inyecta por medio de alta presión en una segunda corriente de componente a 90º entre sí o ambas corrientes se inyectan por medio de alta presión a 90º entre sí. Véanse, por ejemplo, las Figuras 3 y 10 del documento WO 00/29103.

El documento WO 91/16039 desvela un procedimiento para producir liposomas mediante la adición de una solución acuosa directamente en una solución lipídica orgánica presente en un recipiente de reacción, seguido de la mezcla de los componentes con agitación fuerte. Véase, por ejemplo, página 6, líneas 1-7 y Ejemplo 1 del documento WO 91/16039.

El documento US-A-5 653 996 desvela un procedimiento para producir liposomas mediante la pulverización de una solución lipídica orgánica en o bajo la superficie de una solución de tampón acuosa. Véase, por ejemplo, col. 4, líneas 7-14, Figura 1 y la reivindicación 1 del documento US-A-5 653 996.

Isele U y col. en Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 83, nº. 11, Noviembre 1994, págs. 1608-1616 desvela un dispositivo de mezcla en el que las soluciones acuosa y orgánica se bombean en la cámara de mezcla desde el mismo lado. Véase, por ejemplo, la Figura 1 en la página 1069. Por lo tanto, las soluciones acuosa y orgánica no se introducen en el ambiente de mezcla en ningún ángulo particular.

El documento EP-A-0 055 576 desvela un procedimiento para preparar liposomas mediante la dispersión de una solución lipídica que contiene dos disolventes orgánicos diferentes en una solución acuosa. En particular, D9 enseña que el procedimiento preferido para la formación de la dispersión es mediante el pase de la solución lipídica a través de un filtro microporoso (es decir, membrana de policarbonato) antes de que entre en contacto con la solución acuosa presente en el dispersador. Véase, por ejemplo, página 10, líneas 19-26 y Ejemplos 1-IV del documento EP-A-0 055 576.

La patente de Estados Unidos nº 5.478.860, que se expidió a Wheeler y col., el 26 de Diciembre de 1995 y que se incorpora en el presente documento por referencia, desvela composiciones de microemulsión para el suministro de compuestos hidrófobos. Dichas composiciones tienen una diversidad de usos. En una realización, los compuestos hidrófobos son agentes terapéuticos que incluyen fármacos. La patente también desvela procedimientos para suministro in vitro e in vivo de compuestos hidrófobos a células.

La publicación de PCT WO01/05373 de Knopov, y col., que se incorpora por referencia en el presente documento, desvela técnicas para preparar vesículas lipídicas usando un procedimiento de tipo inyección de etanol con un mezclador estático que proporciona un ambiente turbulento (por ejemplo, números de Reynolds > 2000). A continuación pueden cargarse agentes terapéuticos después de la formación de las vesículas.

A pesar de los aparentes avances de la patente de Estados Unidos nº 5.478.860 y el documento WO01/05373, existe una necesidad de procedimientos y aparatos para formular y producir vesículas lipídicas y en particular vesículas lipídicas que encapsulan un agente terapéutico tal como un ácido nucleico. La presente invención satisface esta y otras necesidades.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona procedimientos y aparato para preparar vesículas lipídicas que contienen opcionalmente un agente terapéutico. El agente terapéutico puede incluir, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, un fármaco o similares. La presente invención puede usarse para formar vesículas lipídicas que contienen ADN plasmídico encapsulado o fármacos de moléculas pequeñas. En un aspecto, las vesículas lipídicas se preparan rápidamente a baja presión y el enfoque es completamente escalable. En ciertas realizaciones preferidas, el procedimiento no implica un mezclador estático o equipamiento de extrusión especializado.

Como tal, en una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una vesícula lipídica, preferentemente un liposoma. El procedimiento comprende proporcionar una solución acuosa en un primer depósito; proporcionar una solución lipídica orgánica en un segundo depósito, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico; mezclar dicha solución acuosa con dicha solución lipídica orgánica, mezclándose dicha solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa de modo que se produzca de forma sustancialmente instantánea un liposoma que encapsula el producto terapéutico. El procedimiento se caracteriza por que la mezcla incluye...

1. Un procedimiento para producir una vesícula lipídica que encapsula un producto terapéutico, comprendiendo dicho procedimiento:

proporcionar una solución acuosa en un primer depósito;

proporcionar una solución lipídica orgánica en un segundo depósito, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico;

mezclar dicha solución acuosa con dicha solución lipídica orgánica, mezclándose dicha solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa de modo que se produzca de forma sustancialmente instantánea una vesícula lipídica que encapsula el producto terapéutico; caracterizado porque

la mezcla incluye introducir la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en un ambiente de mezcla a caudales sustancialmente iguales y el ambiente de mezcla incluye un conector T, introduciéndose la solución acuosa y la solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la vesícula lipídica es un liposoma.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho liposoma está en una solución que tiene una concentración de aproximadamente el 20% v/v a aproximadamente el 50% v/v de disolvente orgánico.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente diluir adicionalmente la solución de liposoma.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha dilución adicional es con un tampón.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha dilución adicional de la solución de liposoma es una dilución continua por etapas.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la solución de liposoma tiene una concentración de menos de aproximadamente el 25% v/v de disolvente orgánico después de la dilución.

8. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente retirar dicho disolvente orgánico asociado con dicha solución de liposoma para formar una forma final.

9. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución lipídica orgánica comprende un disolvente orgánico.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho disolvente orgánico es un alcohol inferior.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho disolvente orgánico comprende agua.

12. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución acuosa comprende una solución orgánica.

13. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución acuosa comprende un tampón.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha vesícula lipídica es de menos de aproximadamente 200 nm de diámetro.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha vesícula lipídica se forma a una velocidad de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 ml/min.

16. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución acuosa comprende el producto terapéutico.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho producto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un plásmido, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, ARNt, ARNnp, ARNip, ADN precondensado y un antígeno.

18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho producto terapéutico es un ácido nucleico.

19. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el producto terapéutico es una especie cargada.

20. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha solución lipídica orgánica comprende el producto terapéutico.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el producto terapéutico es lipófilo.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el producto lipófilo se selecciona del grupo que consiste en protax III, Paclitaxol, taxol, derivados de taxol y profármacos derivatizados con lípidos.

23. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que se controla la temperatura de uno o ambos del primer y el segundo depósitos.

24. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que uno o ambos del primer y el segundo depósitos incluyen un recipiente de acero inoxidable con envoltura con un mezclador superior.

25. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que durante la mezcla la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continua por etapas en presencia de la solución acuosa.

26. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma está en una solución que tiene un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,0.

27. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho ácido nucleico codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), una citosina desaminasa, una xantina-guaninfosforribosil transferasa, una p53, una purina nucleósido fosforilasa, una carboxilesterasa, una desoxicitidina quinasa, una nitrorreductasa, una timidina fosforilasa, y un citocromo P450 2B1.

28. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma tiene una eficacia de encapsulación de ácido nucleico de más de aproximadamente el 50%.

29. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma tiene una eficacia de encapsulación de ácido nucleico de entre aproximadamente el 80% y aproximadamente el 90%.

30. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma tiene un diámetro de aproximadamente 150 nm o menos.

31. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho liposoma está en una solución que tiene una concentración salina de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM.

32. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, comprendiendo dicho procedimiento adicionalmente:

proporcionar dicha solución lipídica orgánica que tiene una concentración de aproximadamente el 70% v/v a aproximadamente el 100% v/v de disolvente orgánico en el segundo depósito.

33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que durante la mezcla la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continua por etapas hasta una concentración de aproximadamente el 35% v/v a aproximadamente el 50% v/v de disolvente orgánico.

34. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que el producto terapéutico es uno de una especie aniónica y una especie catiónica.

35. Un aparato para producir una vesícula lipídica que encapsula un producto terapéutico, comprendiendo dicho aparato:

un primer depósito para contener una solución acuosa;

un segundo depósito para contener una solución lipídica orgánica, en el que una de la solución acuosa y la solución lipídica orgánica incluye un producto terapéutico; y

un mecanismo de bomba configurado para bombear dicha solución acuosa y dicha solución lipídica orgánica en una región de mezcla a caudales sustancialmente iguales;

mezclándose la solución lipídica orgánica con dicha solución acuosa en la región de mezcla para formar de forma sustancialmente instantánea una vesícula lipídica con producto terapéutico encapsulado; caracterizado por que

la región de mezcla incluye un conector T, introduciéndose dicha solución acuosa y dicha solución lipídica orgánica en el conector T como flujos opuestos a sustancialmente 180º entre sí.

36. El aparato de la reivindicación 35, en el que la vesícula lipídica es un liposoma.

37. El aparato de la reivindicación 36, que incluye adicionalmente un recipiente receptor para recibir el liposoma con producto terapéutico encapsulado.

38. El aparato de la reivindicación 36, en el que el liposoma está en una solución que tiene una primera concentración, incluyendo adicionalmente el aparato un sistema de filtración acoplado al recipiente receptor, configurándose dicho sistema de filtración para aumentar la concentración de la solución de liposoma con producto terapéutico encapsulado hasta una segunda concentración.

39. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que el producto terapéutico se selecciona del grupo que consiste una proteína, un plásmido, un ácido nucleico, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, ARNt, ARNnp, ARNip, ADN precondensado y un antígeno.

40. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que el mecanismo de bomba incluye una bomba peristáltica.

41. El aparato de la reivindicación 36, en el que durante la mezcla, la solución lipídica orgánica experimenta una dilución continúa por etapas en presencia de la solución acuosa.

42. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que la solución lipídica orgánica incluye el producto terapéutico y en el que el producto terapéutico es lipófilo.

43. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que la solución acuosa incluye el producto terapéutico.

44. El aparato de la reivindicación 35 o 36, en el que el producto terapéutico es uno de una especie aniónica y una especie catiónica.