Un procedimiento para la fabricación de liposomas no pegilados de circulación duradera,

que comprende:

disolver uno o más fosfolípidos y uno o más esteroles en un disolvente o una mezcla de disolventes;

hidratar los lípidos resultantes; y

eliminar dicho(s) disolvente(s) antes o después de dicha hidratación,

en que dicha hidratación es con un medio de hidratación acuoso en una cantidad en el intervalo de 10 a 35 ml por cada milimol de fosfolípido presente en la disolución lipídica para formar liposomas no pegilados, caracterizado por que el medio de hidratación acuoso comprende sacarosa y no menos de 125 milimoles/litro de sulfato amónico

Liposomas no pegilados de circulación duradera.

Campo del invento

El presente invento se refiere a liposomas, que pueden ser utilizados para contener y distribuir agentes diagnósticos o terapéuticos, y a la fabricación de los mismos.

Fundamento del invento

Los liposomas están comúnmente compuestos de fosfolípidos y/o esteroles y consisten en una estructura vesicular basada en bicapas lipídicas que rodean compartimentos acuosos. Varían ampliamente en cuanto a sus propiedades físicoquímicas, tales como el tamaño, la carga superficial y la composición fosfolipídica.

Los liposomas han recibido una atención creciente como posibles vehículos para agentes diagnósticos o terapéuticos. Por ejemplo, se han usado liposomas para distribuir agentes diagnósticos tales como agentes de contraste para la formación magnética de imágenes, tal como el quelato Gd:ácido dietilentriaminopentaacético (Gd-DTPA) (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 6.132.763), y agentes terapéuticos tales como agentes antraciclínicos, de los que se ha mostrado que presentan una acusada actividad frente a una gran variedad de neoplasias (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 4.769.250).

Sin embargo, los liposomas causan agregación en la sangre por su reacción mutua con diversas proteínas del plasma sanguíneo y son capturados por el sistema reticuloendotelial (RES; del inglés, reticuloendothelial system). Por ejemplo, las células de Kupffer del hígado o los macrófagos fijos del bazo atrapan los liposomas antes de que puedan alcanzar su prevista diana. La captura por el RES ha hecho que la distribución selectiva de los liposomas a tejidos o células diana sea muy difícil.

Además de la captura por el RES, los liposomas están sujetos a interacciones electrostáticas, hidrófobas y de Van der Waals con proteínas plasmáticas. Estas interacciones dan lugar a una desestabilización de los liposomas que conduce a que las vesículas sean rápidamente aclaradas de la circulación, a menudo antes de que alcancen su diana.

Además de las interacciones celulares y proteicas con los liposomas, también han surgido dificultades a la hora de producir liposomas que encapsulen ciertos fármacos a causa de las interacciones de los fármacos con los fosfolípidos de los liposomas. Por ejemplo, las antraciclinas han presentado un efecto de tipo tensioactivo o detergente sobre la bicapa fosfolipídica de las vesículas, que causa pérdidas y crea inestabilidad en las vesículas liposómicas. De esta manera, los liposomas inestables frente al ambiente de la circulación y/o frente a su contenido dejarán escapar prematuramente el agente antineoplásico antes de que alcancen el sitio tumoral. Como resultado de los liposomas "que hacen aguas" y de las devastadoras toxicidades resultantes, los científicos han intentado desarrollar liposomas de circulación duradera que sean capaces de extravasarse hacia sitios tumorales, los cuales son de naturaleza muy vascular.

Puesto que los fármacos anticancerosos más comúnmente utilizados no son específicamente tóxicos para células tumorales y son tóxicos para todos los tejidos con los que entran en contacto, crean efectos secundarios indeseables como resultado de sus interacciones con tejidos normales. Por ejemplo, el hidrocloruro de doxorrubicina es uno de los antibióticos antraciclínicos citotóxicos más comúnmente utilizados en la quimioterapia para el cáncer, y se ha mostrado que posee actividad contra una gran variedad de neoplasias. El hidrocloruro de doxorrubicina es eficaz en el tratamiento de muchos tumores sólidos y muchas leucemias. Es particularmente eficaz en el tratamiento de cánceres de mama que implican politerapias. El hidrocloruro de doxorrubicina representa un protocolo terapéutico para el sarcoma de Kaposi relacionado con el sida. El hidrocloruro de doxorrubicina también posee una notable actividad contra tumores de los ovarios, el pulmón, los testículos, la próstata, el cuello uterino, y la cabeza y el cuello, los sarcomas estrogénicos y el sarcoma de Ewing.

Las composiciones convencionales de hidrocloruro de doxorrubicina para inyección son asequibles como un producto liofilizado o como una disolución de hidrocloruro de doxorrubicina en agua. Es necesario que el producto liofilizado sea reconstituido con "agua para inyección" antes de su administración. Estos dos productos comercializados han sido asociados con diversas toxicidades cuando son administrados intravenosamente. La mielosupresión grave es normalmente limitante de la dosis. Otras toxicidades incluyen náuseas y vómitos, alopecia, mucositis (incluyendo estomatitis y esofagitis) y cardiotoxicidad, las cuales pueden limitar el uso del hidrocloruro de doxorrubicina. El hidrocloruro de doxorrubicina es un potente vesicante que puede causar extravasación y necrosis en el lugar de la inyección o en cualquier lugar en que la piel resulte expuesta. La "erupción doxorrubicínica" no es infrecuente y se caracteriza por la formación de estrías eritematosas en el lugar de la inyección. La "erupción doxorrubicínica" remite normalmente en aproximadamente media hora.

No se conoce exactamente el mecanismo de acción del hidrocloruro de doxorrubicina, pero se han estudiado y descrito muchas posibilidades. El mecanismo primario atañe a la capacidad del hidrocloruro de doxorrubicina para intercalarse en el ADN. La integridad del ADN queda significativamente comprometida, lo que da comúnmente lugar a funciones alteradas del ADN. También son comunes las roturas de cadenas sencillas y dobles a causa de la intercalación del hidrocloruro de doxorrubicina en el ADN. Otro mecanismo del hidrocloruro de doxorrubicina atañe a su capacidad para generar radicales libres que provocan daño en el ADN y la membrana celular. Además, el hidrocloruro de doxorrubicina inhibe la topoisomerasa II, lo que hace que la reproducción del ADN sea ineficaz.

Algunos de los efectos tóxicos resultantes del hidrocloruro de doxorrubicina incluyen toxicidad cardiaca, reacción anafiláctica, emetogenicidad, mielosupresión, mucositis, toxicidad cutánea, alopecia, y toxicidad en el sitio de inyección [Cancer Investigation 19 (4): 424-436 (2001)]. En teoría, los sistemas con circulación prolongada (liberación lenta) que distribuyen y liberan eficazmente un fármaco a tumores y en las inmediaciones de las células tumorales son más ventajosos. Por lo tanto, es deseable tener un liposoma estable capaz de encapsular agentes, tal como el hidrocloruro de doxorrubicina, que no libere prematuramente su contenido en tejidos sanos o no cancerosos.

Los diversos planteamientos realizados en un intento para aumentar el tiempo de circulación de los liposomas y asegurar por ello la distribución del contenido de los liposomas en el tejido diana incluyen los siguientes: enmascaramiento de los liposomas frente al reconocimiento del sistema reticuloendotelial, usando un revestimiento de restos de ácido siálico (Patente de EE.UU. nº 4.501.728); aumento de la rigidez de la membrana liposómica con esfingomielina o fosfolípido neutro con cadenas acílicas predominantemente saturadas que contienen de 5 a 20% de glicolípido (Patente de EE.UU. nº 4.920.016); formación de liposomas con una relación de fármaco a lípido 3-80 veces mayor que la de las preparaciones liposómicas tradicionales en un sistema de 3 compartimentos del agente, las bicapas, y un tampón inhibidor de la liberación que contiene ácido cítrico (Patente de EE.UU. nº 6.083.530); incorporación de colesterol al liposoma [Alberto A. Gabizon, Cancer Investigation 19 (4): 424-436 (2001)]; y derivatización del fosfolípido con polietilenglicol (liposomas "pegilados") (Patentes de EE.UU. números 5.013.556 y 6.132.763).

Desafortunadamente, los planteamientos anteriores sólo han mostrado un potencial limitado para prolongar el tiempo de circulación de los liposomas in vivo. Por ejemplo, se ha determinado que el enmascaramiento del liposoma con ácido siálico sólo tiene una capacidad limitada para prolongar las semividas in vivo de los liposomas en circulación (Patente de EE.UU. nº 4.920.016). Para solventar estos problemas, los científicos han revestido la superficie del liposoma con un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol (PEG), para evitar la adsorción de diversas proteínas del plasma sanguíneo por la superficie del liposoma; véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.013.556 y la Patente de EE.UU. nº 5.676.971. Estos liposomas pegilados han sido llamados "liposomas estéricamente estabilizados" o "liposomas sigilosos". Parecía que los liposomas pegilados reducían algunos de los efectos tóxicos causados...

1. Un procedimiento para la fabricación de liposomas no pegilados de circulación duradera, que comprende:

en que dicha hidratación es con un medio de hidratación acuoso en una cantidad en el intervalo de 10 a 35 ml por cada milimol de fosfolípido presente en la disolución lipídica para formar liposomas no pegilados, caracterizado por que el medio de hidratación acuoso comprende sacarosa y no menos de 125 milimoles/litro de sulfato amónico.

2. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la concentración de sacarosa en el medio de hidratación acuoso es de 0,1 M a 0,5 M.

3. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 2, en que la concentración de sacarosa es de 0,25 M a 0,3 M.

4. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 3, en que la concentración de sacarosa es aproximadamente 0,27 M.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el tamaño de los liposomas de la composición liposómica es ajustado a un valor de 0,06 µm a 0,16 µm.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la sal de hidratación extraliposómica es eliminada de la composición liposómica utilizando una disolución tampón para diálisis.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la cantidad del medio de hidratación acuoso utilizado es de 20 a 35 ml por cada milimol de fosfolípido en la disolución lipídica.

8. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7, en que la cantidad del medio de hidratación acuoso utilizado es aproximadamente 30 ml por cada milimol de fosfolípido en la disolución lipídica.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la relación molar de fosfolípido a esterol es de 1:0,1 a 1:2.

10. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 9, en que la relación molar de fosfolípido a esterol es aproximadamente 1:0,7.

11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el fosfolípido es seleccionado entre diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina hidrogenada de soja (HSPC), y derivados de dichos fosfolípidos.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el fosfolípido es diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC).

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el esterol es colesterol.

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además cargar los liposomas con un agente terapéutico o diagnóstico.

15. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 14, en que el agente terapéutico es un agente antineoplásico.

16. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 14, en que el agente antineoplásico es seleccionado entre hidrocloruro de doxorrubicina, hidrocloruro de daunorrubicina e hidrocloruro de epirrubicina.

17. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 16, en que el agente antineoplásico es hidrocloruro de doxorrubicina.

18. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 17, en que el fosfolípido es diestearoilfosfatidilcolina y el esterol es colesterol.

19. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 18, en que la concentración de doxorrubicina encapsulada en los liposomas, expresada como hidrocloruro de doxorrubicina, es de 1 mM a 10 mM.

20. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 19, en que dicha concentración de doxorrubicina es 3 mM - 7 mM.

21. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 20, en que dicha concentración de doxorrubicina es aproximadamente 3,45 mM.

22. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 20, en que dicha concentración de doxorrubicina es aproximadamente 6,9 mM.

23. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18 a 22, en que la relación molar de diestearoilfosfatidilcolina a colesterol es de 1:0,6 a 1:0,8.

24. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18 a 23, en que la relación molar de doxorrubicina encapsulada (como hidrocloruro) a diestearoilfosfatidilcolina es de 1:2 a 1:15.

25. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 24, en que la relación molar de doxorrubicina encapsulada (como hidrocloruro) a diestearoilfosfatidilcolina es aproximadamente 1:3,5.

26. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18 a 25, en que

27. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 26, en que la relación molar de sacarosa a hidrocloruro de histidina en el tampón isotónico utilizado para eliminar el sulfato amónico extraliposómico es de 29:0,1 a 29:10.

28. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 24 o la Reivindicación 25, en que la concentración de sacarosa es de 0,1 M a 0,5 M.

29. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 26 a 28, en que la concentración de hidrocloruro de histidina es de 8 a 12 mM.

30. Un liposoma obtenible mediante un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 2.

31. Un liposoma de acuerdo con la Reivindicación 30, en que el procedimiento es como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 30 cuando dependen directa o indirectamente de la Reivindicación 3.

32. Una composición liposómica no pegilada de doxorrubicina, de circulación duradera, para administración parenteral, que comprende los liposomas de doxorrubicina no pegilados de la Reivindicación 30 o la Reivindicación 31, hidrocloruro de histidina, y sacarosa.

33. Una composición liposómica no pegilada de doxorrubicina, de circulación duradera, para administración parenteral, que comprende los liposomas no pegilados de doxorrubicina de la Reivindicación 30 o la Reivindicación 31, hidrocloruro de histidina, y sacarosa, en que los liposomas no pegilados de doxorrubicina comprenden un fosfolípido, colesterol y sacarosa.

34. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 33, en que el tamaño liposómico y/o los componentes son como se definieron en cualquiera de las Reivindicaciones 5, 9, 10, 11, 12, 13, 18 a 25, 28 y 29.

35. Una composición de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 31 a 34, en que la doxorrubicina (como hidrocloruro) está presente en una cantidad de aproximadamente 2 mg/ml, la relación molar de doxorrubicina a fosfolípido es aproximadamente 1:3,5, y la relación de fosfolípido a colesterol es aproximadamente 1:0,7.

36. Una composición de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 31 a 34, en que la doxorrubicina (como hidrocloruro) está presente en una cantidad de aproximadamente 4 mg/ml, la relación molar de doxorrubicina a fosfolípido es aproximadamente 1:3,5, y la relación de fosfolípido a colesterol es aproximadamente 1:0,7.