PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE BIBLIOTECAS DE PROTEÍNAS Y DE SELECCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE LAS MISMAS.

Procedimiento para la humanización de una célula de hibridoma,

caracterizado porque (a) se transfecta una secuencia de DNA, que codifica a uno o más dominios constantes humanos de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, a la línea celular de hibridoma; (b) la secuencia de DNA de los dominios constantes humanos de la IgG, IgM, IgA, IgD o IgE se flanquea con secuencias de DNA, que son homólogas de las regiones genéticas cromosómicas que flanquean a los dominios constantes del locus de gen de la mencionada célula de hibridoma que codifican a la cadena larga del anticuerpo; (c) se expanden una o más células, que en base a una recombinación homóloga, expresan una cadena larga de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE con una porción constante humanizada; (d) se transfecta una secuencia de DNA, que codifica a un dominio constante kappa o lambda humano, a la línea celular de hibridoma, con lo cual esta secuencia de DNA se flanquea con secuencias de DNA, que son homólogas de las regiones genéticas cromosómicas, que flanquean al dominio constante kappa o lambda del locus de gen activo kappa o lambda de la célula de hibridoma; (e) a continuación se expande una o pocas células que, en virtud de una recombinación homóloga expresan una cadena kappa o lambda con una porción constante humanizada, uniéndose los anticuerpos expresados, mediante el enlace covalente resultante de la variante de empalme de la cadena larga de anticuerpo situada sobre membrana, a la superficie de las células correspondientes que los expresan, lo cual permite la detección y la selección de aquellas células, que presentan dominios de anticuerpo constantes humanizados

La presente invención se refiere a un procedimiento caracterizado con mayor detalle en las reivindicaciones para la humanización de una célula de hibridoma. La presente invención se refiere, pues, a un procedimiento de humanización de una célula de hibridoma, caracterizado porque:

(a) se transfecta a una línea celular de hibridoma una secuencia de DNA que codifica a uno o más dominios constantes de las IgG, IgM, IgA, IgD o IgE humanas;

(b) la secuencia de DNA de los dominios constantes de las IgG, IgM, IgA, IgD o IgE humanas se flanquea con secuencias de DNA, que son homólogas con las regiones genéticas cromosómicas, que flanquean los dominios constantes del locus de gen activo de dichas células de hibridoma, que codifican la cadena larga del anticuerpo;

(c) se expande una o pocas células, que gracias a la recombinación homóloga expresan una cadena larga de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE con una porción constante humanizada;

(d) se transfecta a la línea celular de hibridoma una secuencia de DNA que codifica a un dominio constante kappa o lambda humano, dicha secuencia de DNA está flanqueada por secuencias de DNA que son homólogas con las regiones genéticas cromosómicas, que flanquean el dominio constante kappa o

lambda del locus de gen kappa o lambda activo de la célula de hibridoma;

(e) a continuación se expanden una o pocas células, que por una recombinación homóloga expresan una cadena kappa o lambda con una porción constante humanizada; con lo cual los anticuerpos expresados por la unión covalente de a variante de empalme situada en la membrana de la cadena larga de anticuerpo están unidos a la superficie de las células correspondientes que los han expresado, lo cual permite la detección y la selección de las células en cuestión, que presentan dominios constantes de anticuerpo humanizados.

Hasta ahora se han realizado múltiples intentos encaminados a la producción de anticuerpos que tengan la especificidad deseada, en un rendimiento elevado y con buena compatibilidad humana, en especial anticuerpos destinados a agentes terapéuticos, a continuación se describen brevemente los procedimientos individuales.

Anticuerpos de hibridoma. En la década de los años setenta, Köhler y Milstein desarrollaron un método para la producción de anticuerpos, la técnica del hibridoma (Köhler y Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity; Nature 256, 495-497, 1975). Requiere en primer lugar la inmunización de un animal de ensayo (por lo general un ratón o una rata). A continuación se extraen el bazo o ganglios linfáticos y se obtienen los linfocitos B (materiales previos de la síntesis de células productoras de anticuerpos), que existen en ellos en gran número. Debido a “su” reordenamiento genético individual, cada linfocito B produce anticuerpos que tienen una única especificidad de unión. Los descendientes de este linfocito B, los clones de linfocito B, producen exclusivamente anticuerpos que tienen esta especificidad de unión.

Algunas de las células obtenidas del bazo de un animal inmunizado producen anticuerpos de la especificidad deseada. Para poderlos producir “in vitro”, se tienen que multiplicar los linfocitos B en un cultivo celular. Esto se consigue fusionándolos con células de mieloma, derivadas de un tumor de células plasmáticas. Las células de hibridoma resultantes tienen las propiedades de los dos componentes fusionados: por un lado tienen la inmortalidad de las células cancerosas, por lo lado producen el correspondiente anticuerpo del componente linfocito B. Los descendientes de una célula de hibridoma individual (es decir, su clon) producen anticuerpos que tienen una especificidad definida. Por ello, estos anticuerpos se denominan anticuerpos monoclonales. La técnica de la producción de hibridomas se representa esquemáticamente en la figura 1. Una ventaja de los anticuerpos monoclonales con respecto a los anticuerpos policlonales estriba en que pueden producirse en cantidades en principio ilimitadas gracias a las células que ahora son inmortales.

Inconvenientes. Con la anterior técnica de hibridoma se inmunizan ratones y después se fusionan los linfocitos B de ratón con una línea celular de mieloma. Las células de hibridoma así formadas se propagan después por separado en forma de clones individuales de células y se analiza el líquido sobrenadante de los clones individuales para determinar si tiene la especificidad de anticuerpo deseada. Los clones individuales identificados tienen que subclonar a continuación de modo inmediato en una segunda ronda de selección, ya que en esta fase temporal son genéticamente inestables.

Este procedimiento requiere mucha dedicación de tiempo, de modo que a fin de cuentas solamente podrán verificarse como máximo algunos millares de clones de hibridoma y determinar si tienen la especificidad deseada. La construcción y la exploración de una biblioteca de hibridomas con esta técnica solamente son posibles de forma muy limitada. Por ello, la automatización de este procedimiento es muy difícil. Esta técnica convencional no permite la producción de anticuerpos humanos.

Razas de ratones, que producen anticuerpos de hibridomas humanos. Un caso especial son los anticuerpos de hibridomas humanos, que se obtienen de ratones transgénicos, cuyo lugar o locus de gen de inmunoglobulina se reemplaza por porciones del locus de gen de inmunoglobulina humana (Jakobovits, Production of fully human antibodies by transgenic mice; Curr. Opin. Biotechnol. 6, 561-566, 1995; Lonberg y Huszar, Human antibodies from transgenic mice; Int. Rev. Immunol. 13, 65-93, 1995; Kucherlapati y col., patente US6114598: Generation of xenogeneic antibodies). Los genes de anticuerpos humanos se reordenan, sufren un cambio de clase (class switch) y una hipermutación somática. Estos ratones transgénicos producen, pues, anticuerpos humanos en células de ratones, que (a diferencia de las células de hibridomas

humanos) conducen a hibridomas murinos estables.

Inconvenientes. Es cierto que con esta técnica se pueden producir anticuerpos humanos, pero esta técnica es tan laboriosa y complicada como la técnica de los hibridomas antes debatida. Hasta el presente se sabe muy poco de la calidad real de las razas de ratones transgénicos que se generan. Por ello se han formulado preguntas como las siguientes: Interfieren los anticuerpos humanizados en otras señales de los ratones? Qué calidad tiene la respuesta inmune de los ratones? Cuántos genes de anticuerpo funcionan / están en el genoma del ratón? Etc. Por consiguiente, actualmente no está claro si estos “ratones humanizados” podrán satisfacer las esperanzas que se han puesto en ellos.

Anticuerpos de hibridoma humanizados. Ya se dispone de un gran número de anticuerpos de hibridoma de ratón que son potencialmente interesantes desde el punto de vista terapéutico. Pero un problema para su utilización terapéutica estriba en su origen murino, ya que el sistema inmune humano detecta como ajenas las proteínas de una especie ajena. Esto se aplica también a los anticuerpos de ratón. Surge la llamada respuesta inmune “HAMA” (anticuerpos humanos anti-ratón). En pocos días, los anticuerpos generados por el sistema inmune humano suelen neutralizar los anticuerpos de ratón empleados con fines terapéuticos y los convierten en ineficaces. Por lo tanto, una terapia reiterada solo es posible con muchas limitaciones (Courtenay-Luck y col., Development of Primary and Secondary Immune Responses to Mouse Monoclonal Antibodies Used in the Diagnosis and Therapy of Malignant Neoplasms; Cancer Res. 46, 6489-6493, 1986; Lamers y col., Inhibition of bispecific monoclonal antibody (bsAb) targeted cytolysis by human anti-mouse antibodies in ovarian carcinoma patients treated with bsAb targeted activated T lymphocytes; Int. J. Cancer 60, 450-457, 1995).

La gran mayoría de anticuerpos HAMA va dirigida contra la porción constante de los anticuerpos, razón por la cual se ha pasado a la producción de anticuerpos quiméricos. Estos contienen un dominio variable de anticuerpo de ratón, al que siguen los dominios constantes de anticuerpo humano. Para ello se coloca en primer lugar un gen de anticuerpo humano en un vector de clonación (Wright y col., Genetically engineered Antibodies: Progress and Prospects; Critical Rev. Immunol. 12, 125-168, 1992). Los distintos dominios del anticuerpo forman unidades compactas de plegado, que están unidades entre sí mediante una hebra peptídica. Si se reemplazan dominios completos de anticuerpo, las posibilidades de fallo del funcionamiento de los anticuerpos...

Reivindicaciones

1. Procedimiento para la humanización de una célula de hibridoma, caracterizado porque

(a) se transfecta una secuencia de DNA, que codifica a uno o más dominios constantes humanos de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, a la línea celular de hibridoma;

(b) la secuencia de DNA de los dominios constantes humanos de la IgG, IgM, IgA, IgD o IgE se flanquea con secuencias de DNA, que son homólogas de las regiones genéticas cromosómicas que flanquean a los dominios constantes del locus de gen de la mencionada célula de hibridoma que codifican a la cadena larga del anticuerpo;

(c) se expanden una o más células, que en base a una recombinación homóloga, expresan una cadena larga de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE con una porción constante humanizada;

(d) se transfecta una secuencia de DNA, que codifica a un dominio constante kappa o lambda humano, a la línea celular de hibridoma, con lo cual esta secuencia de DNA se flanquea con secuencias de DNA, que son homólogas de las regiones genéticas cromosómicas, que flanquean al dominio constante kappa o lambda del locus de gen activo kappa o lambda de la célula de hibridoma;

(e) a continuación se expande una o pocas células que, en virtud de una recombinación homóloga expresan una cadena kappa o lambda con una porción constante humanizada, uniéndose los anticuerpos expresados, mediante el enlace covalente resultante de la variante de empalme de la cadena larga de anticuerpo situada sobre membrana, a la superficie de las

células correspondientes que los expresan, lo cual permite la detección y la selección de aquellas células, que presentan dominios de anticuerpo constantes humanizados.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en primer lugar se humanizan los dominios constantes de la cadena corta de anticuerpo y después los dominios constantes de la cadena larga de anticuerpo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que solamente se humanizan los dominios constantes de la cadena larga de anticuerpo o solamente los dominios constantes de la cadena corta de anticuerpo.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que el intrón en dirección al extremo 5' antes del exón M1 del gen activo de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE se acorta en más de 50 pares de bases.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que los dominios constantes humanizados están fusionados con secuencias adicionales de DNA que codifican a proteínas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las secuencias adicionales de DNA que codifican a proteínas codifican a una secuencia de engarce y a un anticuerpo de cadena simple, que está fusionado por el extremo C con el dominio constante de la cadena corta del anticuerpo.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que las regiones homólogas de las secuencias de DNA transfectado a los correspondientes loci de gen de anti

cuerpo de la célula de hibridoma se extienden a lo largo por lo menos de 400 pares de bases.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que para las recombinaciones homólogas no se in

5 troduce en las células ningún marcador de resistencia, que se emplean para la selección de los acontecimientos de recombinación homóloga.