PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE BIBLIOTECAS DE PROTEÍNAS Y DE SELECCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE LAS MISMAS.

Procedimiento para generar una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas,

caracterizado porque (a) en uno o dos lugares (loci) cromosómicos de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación; (b) se expande por lo menos una de las células así modificadas, que como alteración posee las señales específicas de recombinación en los loci de gen; (c) se transfecta a las células expandidas un gran número de secuencias diferentes de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y (d) se integra el gran número de secuencias diferentes de DNA en loci de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, formándose un gran número de células, que en cada caso expresan diversas proteínas, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los loci de gen, y uniéndose las proteínas expresadas a la superficie de las correspondientes células que las han expresado

La presente invención se refiere a un procedimiento caracterizado en las reivindicaciones para la producción de una biblioteca (o banco) de proteínas de gran diversidad y para la selección de proteínas a partir de la misma, en especial de anticuerpos monoclonales humanos que tengan la especificidad deseada. La presente invención se refiere, pues, a un procedimiento para la producción de una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas, caracterizado porque

(a) en una o dos regiones o lugares cromosómicos (loci) de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

(b) se expande por lo menos una de las células así modificadas, que presenta como alteración las señales específicas de recombinación en los lugares (loci) de gen;

(c) en las células expandidas se transfecta un gran número de secuencias diferentes de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

(d) el gran número de secuencias diferentes de DNA se integran en los lugares (loci) de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación

y a la recombinasa específica de las mismas,

formándose un gran número de células, que en cada caso expresan diversas proteínas, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los lugares (loci) de gen, y uniéndose las proteínas expresadas a la superficie de las correspondientes células que se han expresado.

Hasta ahora se han realizado múltiples intentos encaminados a la producción de anticuerpos que tengan la especificidad deseada, en un rendimiento elevado y con buena compatibilidad humana, en especial anticuerpos destinados a agentes terapéuticos, a continuación se describen brevemente los procedimientos individuales.

Anticuerpos de hibridoma

En la década de los años setenta, Köhler y Milstein desarrollaron un método para la producción de anticuerpos, la técnica del hibridoma (Köhler y Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity; Nature 256, 495-497, 1975). Requiere en primer lugar la inmunización de un animal de ensayo (por lo general un ratón

o una rata). A continuación se extraen el bazo o ganglios linfáticos y se obtienen los linfocitos B (materiales previos de la síntesis de células productoras de anticuerpos), que existen en ellos en gran número. Debido a “su” reordenamiento genético individual, cada linfocito B produce anticuerpos que tienen una única especificidad de unión. Los descendientes de este linfocito B, los clones de linfocito B, producen exclusivamente anticuerpos que tienen esta especificidad de unión.

Algunas de las células obtenidas del bazo de un animal inmunizado producen anticuerpos de la especificidad deseada. Para poderlos producir “in vitro”, se tienen que multiplicar los linfocitos B en un cultivo celular. Esto se consigue fusionándolos con células de mieloma, derivadas de un tumor de células plasmáticas. Las células de hibridoma resultantes tienen las propiedades de los dos componentes fusionados: por un lado tienen la inmortalidad de las células cancerosas, por lo lado producen el correspondiente anticuerpo del componente linfocito B. Los descendientes de una célula de hibridoma individual (es decir, su clon) producen anticuerpos que tienen una especificidad definida. Por ello, estos anticuerpos se denominan anticuerpos monoclonales. La técnica de la producción de hibridomas se representa esquemáticamente en la figura 1. Una ventaja de los anticuerpos monoclonales con respecto a los anticuerpos policlonales estriba en que

ratones y después se fusionan los linfocitos B de ratón con una línea celular de mieloma. Las células de hibridoma así formadas se propagan después por separado en forma de clones individuales de células y se analiza el líquido sobrenadante de los clones individuales para determinar si tiene la especificidad de anticuerpo deseada. Los clones individuales identificados tienen que subclonar a continuación de modo inmediato en una segunda ronda de selección, ya que en esta fase temporal son genéticamente inestables.

Este procedimiento requiere mucha dedicación de tiempo, de modo que a fin de cuentas solamente podrán verificarse como máximo algunos millares de clones de hibridoma y determinar si tienen la especificidad deseada. La construcción y la exploración de una biblioteca de hibridomas con esta técnica solamente son posibles de forma muy limitada. Por ello, la automatización de este procedimiento

Un caso especial son los anticuerpos de hibridomas humanos, que se obtienen de ratones transgénicos, cuyo lugar

o locus de gen de inmunoglobulina se reemplaza por porciones del locus de gen de inmunoglobulina humana (Jakobovits, Production of fully human antibodies by transgenic mice; Curr. Opin. Biotechnol. 6, 561-566, 1995; Lonberg y Huszar, Human antibodies from transgenic mice; Int. Rev. Immunol. 13, 65-93, 1995; Kucherlapati y col., patente US-6114598: Generation of xenogeneic antibodies). Los genes de anticuerpos humanos se reordenan, sufren un cambio de clase (class switch) y una hipermutación somática. Estos ratones transgénicos producen, pues, anticuerpos humanos en células de ratones, que (a diferencia de las células de hibridomas humanos) conducen a hibridomas murinos estables.

Inconvenientes

Es cierto que con esta técnica se pueden producir anticuerpos humanos, pero esta técnica es tan laboriosa y complicada como la técnica de los hibridomas antes debatida. Hasta el presente se sabe muy poco de la calidad real de las razas de ratones transgénicos que se generan. Por ello se han formulado preguntas como las siguientes: Interfieren los anticuerpos humanizados en otras señales de los ratones? Qué calidad tiene la respuesta inmune de los ratones? Cuántos genes de anticuerpo funcionan / están en el genoma del ratón? Etc. Por consiguiente, actualmente no está claro si estos “ratones humanizados” podrán satisfacer las esperanzas que se han puesto en ellos.

Anticuerpos de hibridoma humanizados

Ya se dispone de un gran número de anticuerpos de hibridoma de ratón que son potencialmente interesantes desde el punto de vista terapéutico. Pero un problema para su utilización terapéutica estriba en su origen murino, ya que el sistema inmune humano detecta como ajenas las proteínas de una especie ajena. Esto se aplica también a los anticuerpos de ratón. Surge la llamada respuesta inmune “HAMA” (anticuerpos humanos anti-ratón). En pocos días, los anticuerpos generados por el sistema inmune humano suelen neutralizar los anticuerpos de ratón empleados con fines terapéuticos y los convierten en ineficaces. Por lo tanto, una terapia reiterada solo es posible con muchas limitaciones (Courtenay-Luck y col., Development of Primary and Secondary Immune Responses to Mouse Monoclonal Antibodies Used in the Diagnosis and Therapy of Malignant Neoplasms; Cancer Res. 46, 6489-6493, 1986; Lamers y col., Inhibition of bispecific monoclonal antibody (bsAb) targeted cytolysis by human antimouse antibodies in ovarian carcinoma patients treated with bsAb targeted activated T lymphocytes; Int. J. Cancer 60, 450-457, 1995).

La gran mayoría de anticuerpos HAMA va dirigida contra la porción constante de los anticuerpos, razón por la cual se ha pasado a la producción de anticuerpos quiméricos. Estos contienen un dominio variable de anticuerpo de ratón, al que siguen los dominios constantes de anticuerpo humano. Para ello se coloca en primer lugar un gen de anticuerpo humano en un vector de clonación (Wright y col., Genetically engineered Antibodies: Progress and Prospects; Critical Rev. Immunol. 12, 125-168, 1992). Los distintos dominios del anticuerpo forman unidades compactas de plegado, que están unidades entre sí mediante una hebra peptídica. Si se reemplazan dominios completos de anticuerpo, las posibilidades de fallo del funcionamiento de los anticuerpos serán mínimas. Con la invención de la PCR es posible sin ningún problema la producción de cDNA quiméricos, porque con esta técnica se simplifican notablemente las clonaciones exactas. Los anticuerpos quiméricos resultantes...

Reivindicaciones

1. Procedimiento para generar una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas, caracterizado porque

(a) en uno o dos lugares (loci) cromosómicos de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

(b) se expande por lo menos una de las células así

número de secuencias diferentes de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

(d) se integra el gran número de secuencias diferentes de DNA en loci de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, formándose un gran número de células, que en cada caso expresan diversas proteínas, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los loci de gen, y uniéndose las proteínas expresadas a la superficie de las correspondientes células que las han expresado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en el paso (a) tiene lugar la introducción de las señales de recombinación por recombinación homóloga del DNA transfectado con los correspondientes loci de gen, las señales de recombinación del DNA transfectado están flanqueadas por regiones homólogas de los correspondientes loci de gen de la

célula y en el paso (b) se expande por lo menos una de las células alteradas por recombinación homóloga, que como alteración presenta las señales específicas de recombinación en los loci de gen.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 para generar una biblioteca de células eucariotas productoras de anticuerpos, caracterizado porque

(a) en una o dos regiones o lugares cromosómicos (loci) de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

(b) se expande por lo menos una de las células así

número de secuencias diferentes de DNA, que contienen en cada caso distintos genes vH, vlambda o vkappa, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

(d) se integra el gran número de secuencias diferentes de DNA en los loci de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, en el que se genera un gran número de células, que en cada caso expresan anticuerpos distintos, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los loci de gen y en el que los anticuerpos expresados están unidos a la superficie de las

correspondientes células que los han expresado.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que señales de recombinación son señales loxP, FRT

o att.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que las células eucariotas son células de mamíferos o células de hibridoma.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células de mamíferos son linfocitos neoplásicos o precursores de los mismos, células leucémicas o células de linfomas malignos.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 6, en el que los genes vH, genes vlambda y/o genes vkappa son genes humanos.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 2 y de 4 a 7 para la producción de una biblioteca de células productoras de receptores de células T, en el que las distintas secuencias de DNA contienen distintos genes de receptor alfa de T o genes de receptor beta de T.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7 para la producción de una biblioteca de células que expresan exones, en el que las distintas secuencias de DNA contienen distintos exones genómicos, que codifican señales de empalme.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 7, en el que los loci de gen son loci de anticuerpo y contienen el gen vH, gen vlambda o vkappa activos.

11. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que

los loci de gen son loci de receptor de células T y contienen

el gen de receptor alfa T activo o el gen de receptor beta T activo.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 7, 10 y 11, en el que los anticuerpos son anticuerpos humanos monoclonales, que están unidos a la superficie de la célula, que los expresa, mediante enlace covalente.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que los anticuerpos monoclonales humanos expresados por la célula correspondiente por empalme diferencial de los dominios constantes de una IgG, IgM, IgA, IgD o IgE están unidos a la superficie de la célula, que los expresa, mediante enlace covalente.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 13, en el que por cada célula expandida se obtienen más de 102 células distintas, que en cada caso expresan proteínas distintas.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 14, en el que las regiones homólogas del DNA transfectado a los correspondientes loci de gen de la célula, que flanquean a las señales específicas de recombinación, se extienden por lo menos a lo largo de 400 pares de bases.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 11 a 15, en el que el intrón en dirección al extremo 5' antes del exón M1 de un gen de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE se ha acortado en más de 50 pares de bases.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 16, en el que después de la transfección con un gran número de secuencias diferentes de DNA, a partir del gran

número de células distintas resultantes se efectúa un enriquecimiento de aquellas células, que en la superficie celular presentan proteínas unidas a la superficie, que han sido expresadas por las células correspondientes, de modo que se genera una población de células con la mayor diversidad posible de proteínas.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 17, en el que en los pasos de transfección del gran número de secuencias diferentes de DNA a los loci de gen, que en cada caso están flanqueados por sitios de reconocimiento de una recombinasa, se transfectan y/o activan además secuencias de DNA expresables, que codifican a la recombinasa correspondiente.

19. Biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas que puede obtenerse con arreglo a un procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 18, dicha biblioteca es una biblioteca de células eucariotas productoras de anticuerpos.

20. Procedimiento para el aislamiento de un anticuerpo monoclonal que tiene una especificidad deseada, caracterizado porque se incuba una biblioteca según la reivindicación 19 con un antígeno y a continuación se aísla la célula que tiene el antígeno unido a su superficie.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado además porque se aíslan anticuerpos muy afines.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que antes del aislamiento de los anticuerpos muy afines se

realiza la introducción de mutaciones dentro de los genes variables de los anticuerpos.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que la célula se transfecta con un vector de expresión, que

5 expresa la secuencia de DNA que codifica al RAD54, polX mu y/o RecQ4.

24. Procedimiento según la reivindicación 22 ó 23, en el que la célula se transfecta con un vector de expresión, que expresa al RNA antisentido, que es complementario de los

10 genes RAD51B, XRCC2 o XRCC3.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 22 a 24, en el que la célula se transfecta con un gran número de secuencias de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación y en el que el gran

15 número de secuencias de DNA se obtienen por una PCR propensa al error (“error-prone”-PCR).