PROCESO PARA EL AISLAMIENTO SELECTIVO, PURIFICACIÓN Y SEPARACIÓN DE COMPUESTOS 3,17-DICETOESTEROIDES MONOHIDROXILADOS.

Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,

17-dicetoesteroides monohidroxilados a partir de una solución obtenida mediante hidroxilación microbiológica que contiene una mezcla de compuestos esteroides a través de la extracción selectiva, purificación y cristalización selectiva de los compuestos esteroides, caracterizado porque a) se elimina la biomasa del caldo de fermentación, en caso dado después de tratamiento con ácido fosfórico, mediante filtración o centrifugación, se aíslan los compuestos esteroides del filtrado con una cetona o un éster alifático de un alcohol alifático, se eliminan selectivamente las impurezas de tipo no esteroide de la fase orgánica mediante tratamiento con una solución acuosa de carácter básico y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados mediante adición de agua y evaporación del disolvente, y b) se disuelven los compuestos esteroides de la superficie de la biomasa filtrada obtenida en la etapa a) mediante tratamiento con cetonas o alcoholes alifáticos de 1 a 4 carbonos o con una solución acuosa de los mismos y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados después de evaporación del disolvente, luego c) se disuelve el producto obtenido en la etapa a) o en caso dado la mezcla de los dos productos crudos obtenidos en las etapas a) y b) en una cetona o un alcohol alifático de 1 a 4 carbonos miscible en agua o una solución acuosa de los mismos, se decolora la solución y se aíslan los cristales crudos homogéneos purificados después de la evaporación del disolvente, y d) se recristalizan los cristales crudos homogéneos purificados obtenidos en la etapa c) a partir de una mezcla hidrocarburo clorado/hidrocarburo alifático o cicloalifático y se aísla el producto puro

La invención se refiere a un proceso para el aislamiento selectivo, la purificación y la separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados a partir de una solución obtenida preferentemente por vía microbiológica que contiene una mezcla de compuestos esteroides mediante extracción selectiva, purificación y cristalización selectiva de los compuestos esteroides.

Los compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados, por ejemplo 13β-metil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17diona, 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona, 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona y 9α-hidroxi-4-androsteno3,17-diona, así como 6ξ-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona (que es una mezcla de estereoisómeros 6α y 6β) son intermedios clave valiosos en la síntesis química de ingredientes activos tales como desogestrel, gestodeno, drospirenona, así como hidrocortisona, prednisolona y exemestano.

En los procesos industriales, la hidroxilación microbiológica es una práctica de probada eficacia, ya que en muchos casos sólo un microorganismo especial es capaz de hidroxilar una determinada molécula en la posición deseada. En la mayoría de los casos, la síntesis química (si se puede realizar) para resolver este problema es muy complicada, cara, los rendimientos son bajos y se generan numerosos subproductos. En la práctica de la industria farmacéutica, la hidroxilación microbiológica se lleva a cabo de la siguiente manera: en primer lugar se selecciona un microorganismo que es capaz de hidroxilar determinada molécula en la posición deseada mediante screening (cribado), luego se determinan aquellos parámetros óptimos (componentes del nutriente, pH, temperatura, oxígeno disuelto, etc.) que se deben mantener para llevar a cabo la bioconversión a un buen nivel de bioconversión.

Al final del complicado procedimiento mencionado anteriormente, se obtiene un gran volumen de caldo de fermentación y el producto deseado, en nuestro caso el compuesto esteroide monohidroxilado, debe ser aislado de esta solución. El caldo de fermentación es heterogéneo desde el punto de vista tanto físico como químico, contiene células microbianas, así como componentes celulares que se liberan de las células microbianas, el sustrato residual, componentes residuales del nutriente, productos del metabolismo, el producto u subproductos formados, agentes antiespumates, detergentes, etc. La concentración del producto en el caldo de fermentación se encuentra normalmente entre 1 y 10 g/dm3, por tanto, el caldo de fermentación es una “solución diluida” que contiene gran cantidad de impurezas y, naturalmente, el producto deseado en la más alta concentración.

Como se puede observar, el procesamiento posterior de los caldos de fermentación - aislamiento del producto deseado - es un procedimiento muy complicado. El producto deseado y los componentes residuales del nutriente, los productos del metabolismo del microorganismo, los aditivos (agentes antiespumantes, detergentes), el sustrato residual, los subproductos formados y otras impurezas deben ser separados. La situación se complica todavía más, ya que normalmente la solubilidad de los compuestos esteroides en agua es muy baja, con lo que el producto formado está parcialmente en solución, parcialmente precipitado en la superficie de la biomasa. En caso de utilizar una concentración más alta de sustrato, se debe aislar el producto deseado desde dos lugares diferentes: el filtrado del caldo de fermentación y la superficie de la biomasa.

Se han realizado diversos intentos para resolver los problemas mencionados anteriormente. Por ejemplo, según la patente japonesa 54-105294, con el fin de separar mezclas de esteroides, los grupos hidroxilo de los compuestos esteroides son acilados, luego purificados mediante cromatografía en columna utilizando silicagel u óxido de aluminio y finalmente una cristalización fraccionada produce el producto deseado. La publicación no contiene datos cuantitativos referentes a la eficacia del procedimiento, pero el procesamiento posterior de una acilación a escala industrial - utilizando piridina como disolvente - puede causar muchos problemas. En este procedimiento en varias etapas, la pérdida operacional del producto es forzosamente alta y, por tanto, la aplicación del procedimiento no es económica.

La Especificación de Patente EP 245985 describe el aislamiento de compuestos biológicamente activos a escala de laboratorio. Según el procedimiento, la solución tamponada de los compuestos biológicamente activos solubles en agua se extrae con un disolvente especial apropiado inmiscible en agua (por ejemplo polietilenglicol), en presencia de un adsorbente microgranulado (0,01-10 μm) que contiene un grupo funcional. El producto se une de forma reversible al adsorbente del que, después de llevar a cabo los procesos de separación de fases, puede ser recuperado mediante métodos conocidos. La puesta en práctica industrial de este proceso es muy dudosa.

La Especificación de Patente Húngara 192.668 describe la síntesis microbiológica de 15α-hidroxi-4androsteno-3,17-diona. Durante el proceso, la bioconversión se lleva a cabo mediante hongos Penicillium melinii o Fusarium oxysporum f. vasinfectum. La especificación describe brevemente también el método de aislamiento de compuestos esteroides, según el cual el caldo de fermentación se extrae tres veces con isobutil metil cetona (extracción total), se concentran los extractos combinados en un evaporador de película y se evaporan hasta sequedad en un evaporador rotativo utilizando un baño de agua. Se lava el residuo con hexano con el fin de eliminar el agente antiespumante y finalmente cristalizan los compuestos esteroides a partir de isobutil metil cetona. El inconveniente de este proceso es que produce sólo cristales crudos. La descripción no da ninguna instrucción sobre la purificación posterior del producto y la separación de los subproductos esteroides formados ni sobre el sustrato residual.

Según el proceso publicado en la Especificación de Patente Húngara 217.624, los esteroides hidroxilados se aíslan del filtrado de baja concentración (1 g/dm3) del caldo de fermentación utilizando resinas de adsorción macrorreticulares y elución en gradiente. La relación entre el adsorbato y el adsorbente es 1:20, es decir que se necesitan 20 g de resina para unir 1 g de esteroide. El límite del proceso es que, en caso de una concentración más alta (6-10 g/dm3) de sustrato, a escala industrial (20-50 m3), se debe utilizar una gran cantidad de adsorbente, por consiguiente tanto el embalaje como el equipo serían caros y el proceso no resultaría económico.

La patente de Estados Unidos 4.036.695 describe un proceso para la preparación de compuestos de estreno-3,17-diona mediante la fermentación de una 18-alquil-4-estreno-3,17-diona con un cultivo fúngico del género Penicillium o Fusarium. Cuando la conversión ha finalizado, se separa por filtración el hongo micelio y el caldo de cultivo se extrae con metil isobutil cetona. Se combinan las soluciones de extractos orgánicos y se evaporan. El residuo cristalino marrón se purifica y recristaliza para obtener el derivado puro de 15α-hidroxi-18-metil-4-estreno3,17-diona.

Tal como se ha mencionado anteriormente, distintos compuestos esteroides hidroxilados, por ejemplo 13βetil-11α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona, 13β-etil-15α-hidroxi-4-goneno-3,17-diona, 15α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona y 9α-hidroxi-4-androsteno-3,17-diona, así como 6ξ-hidroximetil-1,4-androstadieno-3,17-diona - nuestros compuestos diana - son intermedios clave valiosos en la síntesis química de ingredientes activos tales como desogestrel, gestodeno, drospirenona, así como hidrocortisona, prednisolona y exemestano. Las síntesis químicas son complicadas, son procesos en varias etapas, por tanto la pérdida operacional del producto es forzosamente alta en su práctica a escala industrial. Normalmente se necesitan 8-10 kg del intermedio clave para la síntesis de 1 kg de ingrediente activo. De acuerdo con estos hechos, la síntesis de compuestos esteroides hidroxilados debería llevarse a cabo a gran escala (ocasionalmente varios kg/lote).

La hidroxilación microbiológica de compuestos esteroides puede llevarse a cabo normalmente mediante bioconversión al 60-90%. El problema más importante durante el aislamiento del producto es la separación del sustrato residual y del subproducto formado, ya que en las siguientes etapas de síntesis del intermedio activo sólo se pueden utilizar aquellos productos cuyo contenido de sustrato sea inferior a un... [Seguir leyendo]

1. Proceso para el aislamiento selectivo, purificación y separación de compuestos 3,17-dicetoesteroides monohidroxilados a partir de una solución obtenida mediante hidroxilación microbiológica que contiene una mezcla de compuestos esteroides a través de la extracción selectiva, purificación y cristalización selectiva de los compuestos esteroides, caracterizado porque

a) se elimina la biomasa del caldo de fermentación, en caso dado después de tratamiento con ácido fosfórico, mediante filtración o centrifugación, se aíslan los compuestos esteroides del filtrado con una cetona o un éster alifático de un alcohol alifático, se eliminan selectivamente las impurezas de tipo no esteroide de la fase orgánica mediante tratamiento con una solución acuosa de carácter básico y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados mediante adición de agua y evaporación del disolvente, y

b) se disuelven los compuestos esteroides de la superficie de la biomasa filtrada obtenida en la etapa a) mediante tratamiento con cetonas o alcoholes alifáticos de 1 a 4 carbonos o con una solución acuosa de los mismos y se obtiene el producto cristalino crudo que contiene los esteroides hidroxilados después de evaporación del disolvente, luego

c) se disuelve el producto obtenido en la etapa a) o en caso dado la mezcla de los dos productos crudos obtenidos en las etapas a) y b) en una cetona o un alcohol alifático de 1 a 4 carbonos miscible en agua o una solución acuosa de los mismos, se decolora la solución y se aíslan los cristales crudos homogéneos purificados después de la evaporación del disolvente, y

d) se recristalizan los cristales crudos homogéneos purificados obtenidos en la etapa c) a partir de una mezcla hidrocarburo clorado/hidrocarburo alifático o cicloalifático y se aísla el producto puro.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza acetato de etilo, acetato de n-propilo o isobutil metil cetona como cetona o éster alifático de un alcohol alifático.

3. Proceso según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se ajusta la basicidad y la fuerza iónica de la solución acuosa utilizada para eliminar las impurezas no esteroides mediante la adición de hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos y/o sales básicas de los mismos, tales como carbonatos, bicarbonatos, fosfatos, hidrogenofosfatos, acetatos.