PROCEDIMIENTOS PARA LA SÍNTESIS DE BIBLIOTECAS CODIFICADAS.

La búsqueda de procedimientos más eficientes para identificar compuestos que tienen actividades biológicas útiles ha llevado al desarrollo de procedimientos para la selección de vastas cantidades de compuestos distintos, presentes en las colecciones denominadas como bibliotecas combinatorias. Tales bibliotecas pueden incluir 105 o más compuestos distintos. Existe una variedad de procedimientos para producir bibliotecas combinatorias, y se ha informado la síntesis combinatoria de péptidos, peptidomiméticos y moléculas orgánicas pequeñas. El documento WO 2004/039825 se refiere a codificación enzimática. El documento describe un procedimiento para obtener un complejo bifuncional que comprende un parte de molécula de despliegue y una parte codificadora, en el que un complejo bifuncional naciente que comprende un sitio de reacción químico y un sitio de activación para la adición enzimática de una marca reacciona en el sitio de reacción química con uno o más reactivos, y siempre que las marcas respectivas identifiquen los reactantes en el sitio de activación por medio de una o más enzimas. En una variedad de pocillos, se dispensa un complejo bifuncional naciente que tiene un grupo reactivo (Rx) unido a un oligonucleótido (línea horizontal). En una primera etapa, el grupo reactivo de cada compartimiento reacciona con un reactante, en una segunda etapa un oligonucleótido del codón y una férula se añaden juntos con una ligasa para ligar de modo covalente el oligonucleótido del codón al complejo bifuncional naciente reaccionado, y en una tercera etapa se recupera el producto de ligamiento. El contenido de los pocillos se puede combinar posteriormente y usar como una biblioteca de complejos bifuncionales o se recicla para otra ronda de reacción y adicción de marca. Opcionalmente, el ligamiento se produce entre dos oligonucleótidos de cadena doble, es decir, un oligonucleótido del armazón de cadena doble con una proyección ("extremo adhesivo") se liga a un oligonucleótido bicatenario del codón provisto con una proyección complementaria. El tipo de ligamiento depende de la enzima seleccionada. El ligamiento de la cadena doble es más rápido debido al efecto guía del oligonucleótido que complementan los extremos. El oligonucleótido de complementación también se denomina como la férula oligonucleótido. Después, antes o en forma simultánea con el ligamiento del oligonucleótido del codón al oligonucleótido del armazón ocurre una reacción entre el reactivo libre y el armazón. Se puede usar ligamiento enzimático o químico único (sin un oligonucleótido férula o formador de puente) o bicatenario (usando T4 ligasa). El documento WO 93/20242 se refiere a bibliotecas químicas combinatorias codificadas. El documento describe un procedimiento para sintetizar el complejo bifuncional que tiene una molécula codificada y un polinucleótido identificador capaz de identificar entidades químicas que participan en la síntesis de la molécula codificada, donde la molécula codificada se genera por la reacción de al menos dos de varias entidades químicas asociadas con un polinucleótido identificador, y las entidades químicas se proporcionan por bloques de construcción separados. La biblioteca de complejos bifuncionales comprende 1.000 o más miembros diferentes, tales como 105 o 1012 miembros diferentes. El documento WO 2004/083427 se refiere a la codificación por ligamiento de moléculas pequeñas. El documento describe una biblioteca de moléculas bifuncionales que proporciona un repertorio de diversidad química tal que cada resto químico se liga a una marca genética que facilita la identificación de una estructura química. La biblioteca se puede usar para identificar una estructura química que participa en una unión preseleccionada o reacción de catálisis con una molécula biológicamente activa. Li Xiaoyu et al., J. American Chemical Soc., 126, 5090-5092, (2004) se refiere a la traducción del ADN en Naciloxazolidinas sintéticas. El documento describe la traducción del ADN en N-aciloxazolidinas sintéticas, en que se sintetizan moléculas químicas intermedias de fórmula (YCF)(DAX)(ZBE)S. Gartner Zev et al., Science, 305, 1601-1605, (2004) se refiere a la síntesis orgánica templada por ADN y la selección de una biblioteca de macrociclos. El documento describe la síntesis orgánica templada por ADN para traducir bibliotecas de secuencias de ADN, cada una contiene tres "codones", en bibliotecas de macrociclos de molécula pequeña sintética programada por la secuencia. Los conjugados de ADN-macrociclo resultantes se sometieron a selecciones in vitro para la afinidad de proteínas. Kanan et al., Nature, 431, 545-549, (2004) se refiere al descubrimiento de la reacción permitida por la síntesis templada por ADN y selección in vitro. El documento describe un método de descubrimiento de reacción que usa la síntesis orgánica templada por ADN y la selección in vitro para evaluar simultáneamente muchas combinaciones de sustratos diferentes para las reacciones de formación de enlaces en una solución única. Calderone et al., Current Opinion in Chemical Biology, 8, 645-653, (2004) se refiere a la síntesis templada con ácido nucleico como sistema modelo para traducción antigua. El documento describe la traducción de ácidos nucleicos en estructuras sintéticas con potencial funcional expandido. Calderone et al., Angewandte Cheinic Int Ed., 41, 4104-4108, (20) [Ilegible] que dirige de otro modo reacciones incompatibles en una solución única por medio de la síntesis orgánica templada con ADN. 2 El documento WO 2004/016767 se refiere al desarrollo de la nueva función molecular. El documento describe procedimientos para realizar síntesis templada por ácidos nucleicos (NAT), aumentar la selectividad de las reacciones NAT, realizar reacciones NAT estereoselectivas, seleccionar productos de reacción resultantes de la síntesis de NAT e identificar nuevas reacciones químicas basadas en la síntesis de NAT. Gryaznov et al., J. Amer. Chem. Soc., 115, 3808-3809, (1993) y Czlapinski et al., 123, 8618-8619, (2001) describe el ligamiento químico de los oligonucleótidos en presencia y ausencia de un molde. El documento WO 2005/026387 se refiere a un procedimiento para obtener información estructural concerniente a una molécula codificada. El documento describe un procedimiento para identificar (MI) la molécula de despliegue que tiene afinidad con el blanco molecular, por la mezcla del blanco molecular asociado con los oligonucleótidos blanco, con una biblioteca de complejo bifuncionales que tiene moléculas de despliegue unido a los oligonucleótidos del identificador, acoplamiento de identificadores de complejos, con oligonucleótidos blanco, y deducir la identidad de las moléculas de despliegue y/o blancos moleculares de unión a partir de productos acoplados de identificadores y oligonucleótidos blanco. Los dos mayores desafíos en el uso de métodos combinatorios para el descubrimiento de fármaco son la síntesis de bibliotecas de suficiente complejidad y la identificación de moléculas que son activas en las pruebas usadas. En general se reconoce que a mayor grado de complejidad de una biblioteca, es decir, el número de estructuras distintas presentes en la biblioteca, mayor probabilidad de que la biblioteca contenga moléculas con la actividad de interés. En consecuencia, las reacciones químicas empleadas en la síntesis de la biblioteca deben ser capaces de producir grandes cantidades de compuestos en un marco de tiempo razonable. Sin embargo, para una concentración formal o global determinada, el aumento de la cantidad de miembros diferentes dentro de la biblioteca reduce la concentración de cualquier miembro de biblioteca particular. Esto complica la identificación de moléculas activas de las bibliotecas de alta complejidad. Un método para vencer estos obstáculos ha sido el desarrollo de bibliotecas codificadas, y en particular bibliotecas en las que cada compuesto incluye una marca amplificable. Tales bibliotecas incluyen bibliotecas codificadas por ADN, en las que una marca de ADN que identifica un miembro de la biblioteca se puede amplificar por medio de técnicas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de polimerasa. Sin embargo, el uso de tales procedimientos para producir bibliotecas muy grandes ya está demostrado, y es claro que se requieren mejores procedimientos para producir tales bibliotecas para la realización del potencial de este método para el descubrimiento del fármaco. Compendio de la invención ES 2 365 534 T3 La presente invención proporciona un procedimiento de sintetizar moléculas definidas en las reivindicaciones anexas. El procedimiento utiliza un abordaje "dividir y mezclar" en el que una solución que comprende un iniciador, que comprende un primer bloque de construcción ligado a un oligonucleótido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de sintetizar una molécula que comprende un resto funcional que está unido operativamente a un oligonucleótido codificador que identifica la estructura del resto funcional, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar un compuesto iniciador que consiste en un resto funcional inicial que comprende n bloques de construcción, en el que n es un número entero de 1 o mayor, donde el resto funcional inicial comprende al menos un grupo reactivo, y está unido operativamente a un oligonucleótido inicial, en el que el resto funcional inicial comprende al menos un grupo reactivo, y está unido operativamente a un oligonucleótido inicial; en el que el resto funcional inicial y el oligonucleótido inicial se unen con un resto ligador y en el q ue el oligonucleótido inicial es bicatenario y el resto ligador se acopla covalentemente al resto funcional inicial y a ambas cadenas del oligonucleótido inicial; (b) hacer reaccionar el compuesto iniciador con un bloque de construcción deseado que comprende al menos un grupo reactivo complementario, en el que al menos un grupo reactivo complementario es complementario con el grupo reactivo de la etapa (a), en las condiciones adecuadas para la reacción del grupo reactivo complementario para formar un enlace covalente; (c) hacer reaccionar el oligonucleótido inicial con un oligonucleótido entrante que identifica el bloque de construcción de la etapa (b) en presencia de una enzima que cataliza el ligamiento del oligonucleótido inicial y el oligonucleótido entrante, en condiciones adecuadas para el ligamiento del oligonucleótido entrante y el oligonucleótido inicial para formar un oligonucleótido codificador, en el que el último de dichos oligonucleótidos entrantes comprende una secuencia capuchón, dicha secuencia capuchón que comprende una secuencia de nucleótidos que contiene nucleótidos degenerados; de este modo se produce una molécula que comprende un resto funcional que comprende n+1 bloques de construcción que está unido operativamente a un oligonucleótido codificador que identifica la estructura del resto funcional. 2. Un procedimiento de sintetizar una biblioteca de compuestos, en la que los compuestos comprenden un resto funcional que comprende dos o más bloques de construcción que están unidos operativamente a un oligonucleótido codificador que identifica la estructura del resto funcional, dicho procedimiento que comprende las etapas de (a) proporcionar una solución que comprende m iniciadores del compuesto de la reivindicación 1, en la que m es un número entero de 1 o mayor; (b) dividir la solución de la etapa (a) en r recipientes de reacción, en el que r es un número entero de 2 o mayor, de este modo se producen r alícuotas de la solución; (c) hacer reaccionar los iniciadores del compuesto en cada recipiente de reacción con uno de los r bloques de construcción, dichos bloques de construcción que comprenden al menos un grupo reactivo complementario, en los que al menos un grupo reactivo complementario es complementario con el grupo reactivo de la etapa (a), en condiciones adecuadas para la reacción del grupo reactivo complementario para formar un enlace covalente, de este modo se producen r alícuotas que comprenden compuestos que consiste en un resto funcional que comprende n+1 bloques de construcción unidos operativamente al oligonucleótido inicial; y (d) hacer reaccionar el oligonucleótido inicial en cada alícuota con uno de un conjunto de r oligonucleótidos entrantes distintos que corresponden al bloque de construcción de la etapa (c) en presencia de una enzima que cataliza el ligamiento del oligonucleótido entrante y el oligonucleótido inicial, en condiciones adecuadas para ligamiento enzimático del oligonucleótido entrante y el oligonucleótido inicial para formar un oligonucleótido codificador, en el que el último de dichos r oligonucleótidos entrantes distintos comprenden una secuencia capuchón, dicha secuencia capuchón que comprende una secuencia de nucleótidos que contiene nucleótidos degenerados; de este modo se producen r alícuotas que comprenden moléculas que consisten en un resto funcional que comprende n+1 bloques de construcción unidos operativamente a un oligonucleótido codificador que identifica la estructura del resto funcional que comprende los n+1 bloques de construcción, 3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el resto funcional de la etapa (c) comprende un grupo reactivo, y las etapas (a) a (c) se repiten una vez o más veces, de este modo se formar ciclos 1 a i, donde i es un número entero de 2 o mayor, donde el producto de la etapa (c) de un ciclo s, donde s es un número entero de i-1 o menor, es el compuesto iniciador del ciclo s + 1. 4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la etapa (c) precede a la etapa (b) o la etapa (b) precede a la etapa (c). 5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que al menos uno de los bloques de construcción es un 228 aminoácido o un aminoácido activado. 6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la enzima se selecciona del grupo que consiste en un ADN ligasa, una ARN ligasa, una ADN polimerasa, un ARN polimerasa y una topoisomerasa. 7. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el oligonucleótido inicial comprende una secuencia del cebador de PCR. 8. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el oligonucleótido entrante tiene 3 a 10 nucleótidos de longitud. 9. El procedimiento de la reivindicación 3, que además comprende después del ciclo i, la etapa de (e) ciclar el resto funcional; opcionalmente en el que el resto funcional comprende un grupo alquinilo y un grupo azido, y el compuesto se somete a condiciones adecuadas para cicloadición del grupo alquinilo y el grupo azido para formar un grupo triazol, de este modo se cicla el resto funcional. 10. El procedimiento de la reivindicación 2, que además comprende la etapa de (e) combinar dos o más de las r alícuotas, de este modo se produce una solución que comprende moléculas que consisten en un resto funcional que comprende n + 1 bloques de construcción, que está unido operativamente a un oligonucleótido codificador que identifica la estructura del resto funcional que comprende los n +1 bloques de construcción. 11. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que se combinan r alícuotas. 12. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que las etapas (a) a (e) se realizan una o más veces para producir ciclos 1 a i, donde i es un número entero de 2 o mayor, en el que en el ciclo s+1, donde s es un número entero de i-1 o menor, la solución que comprende m iniciadores del compuesto de la etapa (a) es la solución de la etapa (e) del ciclo s, opcionalmente en el que en al menos uno de los ciclos 1 a i de la etapa (d) precede a la etapa (c). 13. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el resto ligador comprende un primer grupo funcional adaptado para unirse con un bloque de construcción, un segundo grupo funcional adaptado para unirse al extremo 5' de un oligonucleótido, y un tercer grupo funcional adaptado para unirse al extremo 3' de un oligonucleótido. 14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que el resto ligador es de la estructura en el que A es un grupo funcional adaptado a unirse a un bloque de construcción; B es un grupo funcional adaptado a unirse al extremo 5' de un oligonucleótido; C es un grupo funcional adaptado a unirse al extremo 3' de un oligonucleótido; S es un átomo o un armazón; D es una estructura química que conecta A a S; E es una estructura química que conecta B a S; y F es una estructura química que conecta C a S; opcionalmente en el que (i) A es un grupo amino; B es un grupo fosfato; y C es un grupo fosfato; o ES 2 365 534 T3 229 (ii) en el que D, E y F son cada uno de modo independiente, un grupo alquileno o un grupo oligo(etilenglicol); o (iii) en el que S es un átomo de carbono, un átomo de nitrógeno, un átomo de fósforo, un átomo de boro, un grupo fosfato, un grupo cíclico o un grupo policíclico; opcionalmente en el que el resto ligador es de la estructura en el que cada uno de n, m y p es, de modo independiente, un número entero de 1 a aproximadamente 20; opcionalmente (A) en el que cada uno de n, m y p es de modo independiente un número entero de 2 a ocho, opcionalmente en el que cada uno de n, m y p es de modo independiente un número entero de 3 a 6; o (B) en el que el resto ligador tiene la estructura 15. El procedimiento de la reivindicación 9, que además comprende el siguiente ciclo i, la etapa de: (f) ciclar uno o más de los restos funcionales; opcionalmente en el que un resto funcional de la etapa (f) comprende un grupo azido y un grupo alquinilo; opcionalmente en el que el resto funcional se mantiene en condiciones adecuadas para la cicloadición del grupo azido y el grupo alquinilo para formar un grupo triazol, de este modo forma un resto funcional cíclico; opcionalmente en el que la reacción de cicloadición se realiza en la presencia de un catalizador de cobre; opcionalmente en el que al menos uno del uno o más restos funcionales de la etapa (f) comprende al menos dos grupos sulfhidrilo, y dicho resto funcional se mantiene en condiciones adecuadas para la reacción de los dos grupos sulfhidrilo para formar un grupo disulfuro, de este modo cicla el resto funcional. 16. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el grupo reactivo y el grupo reactivo complementario se seleccionan del grupo que consiste en (i) un grupo amino; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo; un grupo fosfonilo; un grupo epóxido; un grupo aziridina; y un grupo isocianato; o (ii) un grupo hidroxilo; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo; un grupo fosfonilo; un grupo epóxido; un grupo aziridina; y un grupo isocianato; o (iii) un grupo amino y un grupo aldehído o cetona, opcionalmente en el que la reacción entre el grupo reactivo y el grupo reactivo complementario se realiza en condiciones reductoras; o (iv) un grupo iluro de fósforo y un grupo aldehído o cetona. 17. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el grupo reactivo y el grupo reactivo complementario reacciona por medio de la cicloadición para formar una estructura cíclica, opcionalmente en el que el grupo reactivo y el grupo reactivo complementario se seleccionan del grupo que consiste en (i) un alquino y una azida; o ES 2 365 534 T3 (ii) un grupo heteroaromático halogenado y un nucleófilo; opcionalmente en el que el grupo heteroaromático halogenado se selecciona del grupo que consiste en pirimidinas clorados, triazinas cloradas y purinas cloradas; o en el que el nucleófilo es un grupo amino. 18. Un procedimiento para identificar uno o más compuestos que unen a un blanco biológico, dicho procedimiento que comprende las etapas de: ES 2 365 534 T3 (a) poner en contacto el blanco biológico con un biblioteca de compuestos preparada por el procedimiento de la reivindicación 2 en condiciones adecuadas para al menos un miembro de la biblioteca de compuestos para unirse al blanco; (b) eliminar miembros de biblioteca que no se unen al blanco; 5 (c) amplificar los oligonucleótidos codificadores del al menos un miembro de la biblioteca de compuestos que se une al blanco; (d) secuenciar los oligonucleótidos codificadores de la etapa (c); y (e) usar las secuencias determinadas en la etapa (d) para determinar la estructura de los restos funcionales de los miembros de la biblioteca de compuestos que se unen al blanco biológico; 10 de este modo se identifican uno o más compuestos que se unen al blanco biológico. 19. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha secuencia capuchón comprende la siguiente secuencia: 3'- AA GTCGCAAGCT NNNNN GTCTGTTCGAAGTGGACG - 5', en el que N es cualquiera de A, T, G o C. 20. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha secuencia capuchón comprende la siguiente secuencia: 3' - AA GTCGCAAGCTACG ABBBABBBABBBA GACTACCGCGCTCCCTCCG - 5', en el que B es cualquiera de T, G, o C. 21. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las reacciones se realizan en solución. 22. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la molécula sintetizada es un compuesto polimérico. 23. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la molécula sintetizada es un compuesto no polimérico. 231 ES 2 365 534 T3 232 Figura 2 ES 2 365 534 T3 233 Figura 3 ES 2 365 534 T3 234 ES 2 365 534 T3 Figura 4 Figura 5 ES 2 365 534 T3 236 Figura 6 ES 2 365 534 T3 237 Figura 7 ES 2 365 534 T3 238 ES 2 365 534 T3 Figura 8 239 Figura 9 ES 2 365 534 T3 Figura 10 ES 2 365 534 T3 241 Figura 11 ES 2 365 534 T3 242 Figura 12 ES 2 365 534 T3 243 Figura 13 ES 2 365 534 T3 244