PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE UN DISPOSITIVO PARA DIAGNOSTICO DE MUTACIONES FRECUENTES DE LA PROTEINA LRRK2 BASADO EN PCR EN TIEMPO REAL.
La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un dispositivo para diagnóstico de mutaciones frecuentes de la proteína Irrk2 basado en PCR en tiempo real,
consistente en un sistema de diagnóstico in vitro basado en PCR en tiempo real utilizando SYBR green I como fluorocromo que permite el diagnóstico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G del gen LRRK2 humano.Dispone de una placa de 96 pocillos que genotipa hasta 12 muestras procedentes de DNA humano, obtenido a partir de sangre o frotis bucal, empleándose secuencias de oligonucleótidos específicas que permiten la detección mediante la técnica de PCR del genotipo concreto de la muestra analizada basado en una reacción de tipo multiplex, que en una única reacción indica el genotipo (homocigótico mutante, homocigótico silvestre o heterocigótico) de la muestra analizada
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930533.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
FUNDESALUD.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: BADAJOZ.
Inventor/es: MORAN GARCIA,JOSE MARIA, FUENTES RODRIGUEZ,JOSE MANUEL.
Fecha de Solicitud: 29 de Julio de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 20 de Junio de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68D2G
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2344881_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de obtención de un dispositivo para diagnóstico de mutaciones frecuentes de la proteína LRRK2 basado en PCR en tiempo real.
La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un dispositivo para diagnóstico de mutaciones frecuentes de la proteína LRRK2 basado en PCR en tiempo real.
La indicación PCR identifica la reacción de la polimerasa en cadena.
Sector de la técnica
Esta invención se destina al sector de la técnica de diagnóstico clínico e investigación básica.
Estado de la técnica
Actualmente no existe en el mercado ningún dispositivo comercial que permita el diagnóstico directo de las mutaciones indicadas del gen LRRK2. Cualquier procedimiento de diagnóstico incluye necesariamente a día de hoy una de las siguientes tres opciones:
El diagnostico basado en RFLP requiere de al menos 2 pasos diferenciados, y en condiciones habituales tienen una duración de 24 horas. Los pasos necesarios son PCR (reacción de la polimerasa en cadena) seguido de restricción enzimática. El procedimiento es eficaz y con un coste económico asumible sin embargo tiene tres grandes debilidades:
En el caso de las mutaciones R1441G/C/H es necesario añadir un paso adicional de secuenciación del DNA para poder discernir que tipo de mutación es la presente. El método es absolutamente fiable y no dejará ningún lugar a dudas respecto del resultado sin embargo la secuenciación también tiene algunas debilidades:
La realización de la técnica se basa en la utilización de dos aproximaciones experimentales previamente descritas pero nunca aplicadas al diagnóstico de mutaciones del gen LRRK2.
La primera técnica previamente descrita es la introducción de mutaciones adicionales en la secuencia del primer directo en el extremo 3' en la posición tercera contando desde ese mismo extremo. Teniendo en cuenta que el primer debe diseñarse de forma que la mutación que se quiere analizar quede en ese extremo 3', la adición de una mutación más en la posición tercera hace que la especificidad del primer aumente de manera notable de forma que con esa modificación adicional el primer es altamente específico y permite la diferenciación entre el genotipo silvestre y el genotipo mutante.
La segunda técnica es la inclusión en uno de los primeros correspondiente al alelo en cuestión de una cola rica en "GC" de forma que el producto generado de PCR tenga una temperatura de desnaturalización mayor y pueda ser analizado en la misma carrera mediante la correspondiente curva de desnaturalización. La unión de las dos técnicas previamente indicadas permite la realización de todo el proceso en una sola carrera mediante un PCR de tipo multiplex.
Ambas aproximaciones han sido previamente descritas por el grupo de Papp AC y colaboradores y publicadas en la revista Biotechniques. 2003 May;34(5):1068-72.
Descripción de la invención
La presente invención incluye la posibilidad de desarrollar dos tipos distintos, aunque complementarios de productos:
Prototipo tipo A: Desarrollo de una placa de diagnóstico comprensiva de las mutaciones G2019S; R1441C/G/H y sus respectivos controles. Permitiría el diagnóstico de hasta 12 pacientes de una sola vez, en un único análisis y con una duración aproximada del mismo de unas 2 horas y en un solo paso (Fig. 1). El dispositivo sería optimizado para partir de DNA obtenido tanto mediante procedimientos invasivos (muestras sanguíneas) como no invasivos (frotis bucales). Este sistema está más orientado hacia actividades de tipo asistencial y diagnóstico en hospitales.
Prototipo tipo B: Desarrollo de un sistema de diagnostico individual para cada una de las mutaciones. Cada kit incluiría todo lo necesario para poder diagnosticar la presencia de una mutación concreta (G2019S o R1441C/H/G) así como los controles necesarios a partir de una muestra individual de DNA procedente de sangre o frotis bucales. El ensayo podría llevarse igualmente a cabo en un tiempo no superior a 2 horas y en un único paso mediante la utilización de placas o tubos de reacción procedentes de cualquier fabricantes y adaptados a las características del equipo de PCR en tiempo real.
Características comunes a ambas propuestas son: la economía, la velocidad y la eficiencia.
Es el primer sistema de diagnóstico de mutaciones frecuentes relacionadas con la Enfermedad de Parkinson comercializado.
El sistema utiliza las siguientes tecnologías/materiales/productos que tendrían que ser proveídos por terceros participantes:
Para el Prototipo tipo A:
• Soporte plástico (placa de 96 well)
• Fijado de los primeros en la placa
• Polimerasas/dNTPs/Otros para la reacción en tiempo Real.
• Fluorocromo SYBR-green I
Para el Prototipo tipo B:
• Polimerasas/dNTPs/Otros para la reacción en tiempo Real.
• Fluorocromo SYBR-green I.
Por parte de nuestro equipo se han diseñado un total de 12 secuencias de oligonucleótidos específicos, basados en la secuencia publica (traducción de leucine-rich repeat kinase 2 gene ID 120892) del gen LRKK2 humano accesible desde el GeneBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Dichas secuencias son únicas y han sido diseñadas específicamente por nuestro equipo no existiendo copias de las mismas en ningún otro dispositivo o sistema de diagnóstico parecido.
(Tabla pasa a página siguiente)
La idea de sistema diagnóstico tal y como nos referimos en el prototipo A debe entenderse como "un sistema de diagnóstico in vitro basado en PCR en tiempo real utilizando SYBR green I como fluorocromo que permite el diagnostico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G del gen LRRK2 humano". El sistema consta de una placa de 96 pocillos que genotipa hasta 12 muestras procedentes de DNA humano ya sea obtenido a partir de sangre o de frotis bucales facilitando el genotipo completo (homocigótico silvestre, homocigótico mutante o heterocigótico) de cada una de las mutaciones indicadas para el paciente en cuestión.
La idea de sistema de diagnóstico tal y como nos referimos en el prototipo B debe entenderse como "un sistema de diagnóstico in vitro que permite la detección de una mutación aislada del gen LRRK2: G2019S, R1441C, R1441H o R1441G; basado en PCR en tiempo real utilizando el fluorocromo SYBR green I y que a partir de muestras procedentes de DNA humano ya sea obtenido a partir de sangre o de frotis bucales facilita el genotipo completo (homocigótico silvestre, homocigótico mutante o heterocigótico) de la muestra en cuestión".
Respecto de las secuencias de oligonucleótidos utilizados indicar que son secuencias específicas que permiten la detección mediante la técnica de PCR del genotipo concreto de la muestra analizada basado en una reacción de tipo multiplex, que en una única reacción indica el genotipo (homocigótico mutante, homocigótico silvestre o heterocigótico) de la muestra analizada. Los oligonucleótidos utilizados han sido modificados sintéticamente y su diseño es único, no derivan directamente de la secuencia del gen si no que se han introducido modificaciones en los mismos que son indispensables para alcanzar la sensibilidad deseada... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para el diagnostico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G de la proteína LRRK2 basado en una sola PCR múltiple en tiempo real, caracterizado por los oligonucleótidos cebadores:
SEQ ID Nº 1
SEQ ID Nº 2
SEQ ID Nº 3
SEQ ID Nº 4
SEQ ID Nº 5
SEQ ID Nº 6
SEQ ID Nº 7
SEQ ID Nº 8
2. Procedimiento para el diagnostico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G de la proteína LRRK2 basado en una sola PCR múltiple en tiempo real, según la primera reivindicación, caracterizada porque la detección de la mutación R1441G, implica la utilización de los siguientes oligonucleótidos:
- SEQ ID Nº 5
- SEQ ID Nº 7
- SEQ ID Nº 8
Los tres oligonucleótidos se utilizan simultáneamente en una reacción de PCR en tiempo real con SYBR-green, que permite discriminar en cada reacción si el genotipo es homocigótico mutante, homocigótico recesivo o heterocigoto respecto de la mutación estudiada. Las condiciones del PCR en tiempo real básicas son:
4 mM MgCl2
DMSO 5%
SYBR@ GREEN 1X
Annealing: 60ºC
Ciclos: 40.
Una vez transcurrida la carrera se procede a realizar una curva de desnaturalización del producto de PCR entre 65ºC y 95ºC con intervalos de toma de temperatura del 1%.
3. Procedimiento para el diagnostico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G de la proteína LRRK2 basado en una sola PCR múltiple en tiempo real, según reivindicación primera, caracterizada porque como muestras de control, se han utilizado preparaciones de plasmidos conteniendo fragmentos de entre 300 y 400 pares de bases del gen de LRRK2 humano. Dichos plasmidos han sido sintetizados artificialmente en un laboratorio externo y posteriormente secuenciados para garantizar la presencia de la mutación. A partir de las diluciones de plasmidos originales, se han construidos moldes homocigotos mutantes, homocigotos silvestres y heterocigotos siempre de forma equimolar.
4. Procedimiento para el diagnostico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G de la proteína LRRK2 basado en una sola PCR múltiple en tiempo real, según reivindicación primera, caracterizada porque se desarrolla un sistema de diagnostico individual para cada una de las mutaciones. Cada dispositivo incluiría todo lo necesario para poder diagnosticar la presencia de una mutación concreta (G2019S o R1441C/H/G) así como los controles necesarios a partir de una muestra individual de DNA procedente de sangre o frotis bucales, utilizando polimerasas/dNTPs/Otros para la reacción en tiempo Real y Fluorocromo SYBR-green I.
5. Procedimiento para el diagnostico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G de la proteína LRRK2 basado en una sola PCR múltiple en tiempo real, según reivindicación primera, caracterizado por disponer de una placa de 96 pocillos que genotipa hasta 12 muestras procedentes de DNA humano, obtenido a partir de sangre o frotis bucal.
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