Un procedimiento de producción de una molécula efectora de ARN bicatenaria adecuada para uso en la inhibición de la replicación de un virus de la hepatitis C (HCV),

o una construcción de expresión que exprese dicha molécula, comprendiendo dicho procedimiento: a) seleccionar la región del intermedio de replicación de hebra no codificante correspondiente a la región 3' no traducida conservada de dicho virus HCV como diana; b) diseñar una molécula efectora de ARN bicatenaria para orientarse selectivamente a dicha región del intermedio de replicación de hebra no codificante, comprendiendo dicha molécula efectora de ARNbc una hebra efectora que tiene una secuencia de al menos 19 nucleótidos contiguos de un complemento inverso de dicha región del intermedio de replicación de hebra no codificante; y c) producir dicha molécula efectora de ARNbc o una construcción de expresión que exprese dicha molécula

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a procedimientos de producción de una molécula efectora bicatenaria adecuada para inhibir, suprimir o regular por disminución la replicación vírica mediante silenciamiento génico mediado por ARN bicatenario (ARNi), en los que la molécula efectora bicatenaria se orienta preferiblemente a intermedios de replicación de hebra no codificante de virus monocatenarios.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Ha habido un interés considerable en el desarrollo de composiciones basadas en ácido nucleico para aplicaciones antivíricas, incluyendo composiciones anticodificantes, composiciones basadas en ARN bicatenario, oligonucleótidos formadores de triple hélice, ribozimas, etc. Su modo de acción específico de secuencia ofrece la promesa de terapias que tienen un alto nivel de seguridad y eficacia. Los procedimientos aceptados actualmente de regulación por disminución de ARN víricos de virus de hebra codificante implican en gran medida orientarse directamente a los ARN de hebra codificante. Por ejemplo, se cree que los oligonucleótidos anticodificantes funcionan hibridando con un ARNm, interfiriendo así con la traducción del ARNm a proteína. Los oligonucleótidos anticodificantes se diseñan por lo tanto habitualmente para ser complementarios de un ARNm diana. La patente de EE.UU. nº 6.001.990, por ejemplo, "Antisense inhibition of hepatitis C virus", describe oligonucleótidos sustancialmente complementarios de secuencias de ARN genómico de HCV, concretamente, secuencias que son complementarias de y se orientan a la hebra codificante del genoma de HCV. De forma similar, se ha pensado que el ARNi está conectado mecanísticamente con la traducción, de modo que los ARN que no se traducen son refractarios a la inhibición de ARNip, mientras que aquellos que se traducen activamente son dianas eficaces. Véase Wang y Carmichael, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68: 432-452 (2004). Véase también, por ejemplo, Yokota y col., EMBO Rep. 4: 602-08 (2003), que describen la orientación de ARNip a 5'UTR de ARN genómico de HCV. Krönke y col., J. Virol. 78 (7): 3436-46 (2004), evaluaron ARNip dirigidos contra ARN genómico de HCV que incluye diversas regiones de la secuencia de codificación así como la 5'-NTR, y notificaron que grandes secciones de las NTR son resistentes a ARNi. Sin embargo, especularon que una secuencia dirigida a la 5'NTR puede haberse orientado realmente al extremo 3' de la hebra no codificante, contribuyendo posiblemente a su actividad antivírica. Las ribozimas parecen ser una excepción a la orientación a HCV de hebra codificante, describiendo la patente de EE.UU. nº 6.107.028 ribozimas que se orientan a las hebras codificante y/o no codificante del HCV.

Un gran número de virus de relevancia clínica producen moléculas de ARN durante la replicación que no son moléculas de ARN mensajero. Por ejemplo, los virus de ARN de hebra codificante tales como de la hepatitis C (HCV) generan un ARN denominado de hebra no codificante que es complementario de y de polaridad opuesta (extremos 5' frente a 3') a los diversos ARNm preparados por el virus. La variabilidad de secuencia extrema y la alta tasa de mutación de los virus de ARN tales como el HCV proporcionan un impulso a la orientación a las regiones conservadas diana del ARN genómico vírico. Sin embargo, la estructura secundaria compleja de las regiones conservadas del HCV, así como la presencia de proteínas celulares y víricas que se unen a estas regiones conservadas en el entorno intracelular, crean incertidumbre en cuanto a la aplicabilidad de enfoques antivíricos basados en ácido nucleico para estas regiones diana preferidas por lo demás. Smith y col. cartografiaron regiones conservadas de ambas hebras codificante y no codificante de HCV para determinar la estructura secundaria y la accesibilidad a la hibridación de construcciones anticodificantes. Véase J. Virol. 76 (19): 9563-74 (2002), "Secondary Structure and Hybridization Accessibility of Hepatitis C Virus 3'-Terminal Sequences", y también Smith y col., J. Viral Herat., 11 (2): 115-23 (2004).

De forma similar, el ARN interferente (ARNi) se ha usado para orientarse a la destrucción selectiva de moléculas de ARNm producidas por virus en estrategias con el objetivo de crear agentes antivíricos eficaces. Como los anticodificantes, los ARNi mediados por ARNbc se basan en interacciones de ácido nucleico específicas de secuencia, pero la implicación del complejo silenciador inducido por ARN (RISC) multiproteico plantea la duda de si la accesibilidad a anticodificante sola se correlaciona con la accesibilidad a diana para la degradación de ARNi. Además, puesto que las estrategias de ARNi emplean moléculas de ARN bicatenarias (ARNbc), que contienen secuencias tanto idénticas como complementarias de una diana vírica, no se ha demostrado un procedimiento de orientación de, por ejemplo, un ARN de hebra no codificante preferiblemente a su ARNm vírico complementario. A su vez, no se ha demostrado anteriormente la potencia de un agente antivírico que funcione orientándose selectivamente, por ejemplo, a la hebra no codificante (de un virus de ARN de hebra codificante) en lugar de a su ARNm o productos proteicos. La presente invención proporciona un procedimiento para producir ARNi que se orienta preferiblemente a la destrucción de, por ejemplo, la hebra no codificante de un virus de ARN de hebra codificante, y describe también composiciones novedosas basadas en este procedimiento para una inhibición potente de la replicación de virus de ARN tales como HCV.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La aplicación aceptada actualmente de ARN interferente (ARNi) mediado por ARN bicatenario (ARNbc) se ha limitado en gran medida a moléculas diana clasificadas como ARN mensajero (ARNm). Se ha pensado que el ARNi está conectado mecanísticamente con la traducción, de modo que los ARN que no se traducen son refractarios a la inhibición por ARNip, mientras que aquellos que se traducen activamente son dianas más eficaces. Véase Wang y Carmichael, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68: 432-452 (2004). Aunque una serie de virus (particularmente virus de ARN conocidos como virus de hebra codificante) producen también moléculas de ARN que no son ARNm, las estrategias para inhibir las funciones víricas usando ARNbc se han orientado al ARNm (o al ARN genómico análogo) producido por el virus, incluyendo secuencias de codificación así como regiones no traducidas. Véanse, por ejemplo, Yokota y col., EMBO Rep. 4:602-08 (2003); Kapadia y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 2014-18 (2003); Wilson y col., J. Virol. 79 (11): 7050-58 (2005); Krönke y col., J. Virol. 78(7): 3436-46 (2004).

En contraposición, los procedimientos de la invención se orientan a ARN de hebra no codificante de virus de hebra codificante, específicamente HCV, y más específicamente a la región del intermedio de replicación de la hebra no codificante correspondiente a la región 3' no traducida conservada de HCV. Los solicitantes han descubierto que, sorprendentemente, puede conseguirse una actividad antivírica superior orientándose al intermedio de replicación de hebra “no codificante” (hebra de ARN antigenómica) de estos virus, concretamente, orientándose a la hebra no codificante de virus de hebra codificante. No solo dichas moléculas de ARNbc están diseñadas para orientarse preferiblemente a la hebra no codificante altamente activa, sino que utilizar la hebra no codificante como punto de partida para el diseño de ARNbc da como resultado una mayor proporción de moléculas activas. Este enfoque tiene la ventaja distintiva de destruir o regular por disminución una población de ARN que es menos abundante que el correspondiente mensaje de hebra principal. Esto significa que se requerirá una cantidad menor de ARN bicatenario efector para conseguir el objetivo deseado de eliminar el virus. Debido a que estas hebras “no codificantes” son un intermedio necesario para la replicación vírica, la destrucción o regulación por disminución de estas hebras conducirá a una reducción o eliminación de la replicación vírica. La utilización de la hebra “no codificante” como diana para el ataque de ARNi proporciona también un intervalo extendido de dianas antivíricas potenciales y por tanto un intervalo extendido de agentes potenciales activos contra un virus particular. Considerando la alta tasa de mutación de los virus de ARN tales como HCV, una terapia antivírica eficaz necesita la utilización de un régimen multifármaco. En un aspecto, por lo tanto, pueden usarse uno o más de dichos ARNbc orientados a hebra no codificante,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una molécula efectora de ARN bicatenaria adecuada para uso en la inhibición de la replicación de un virus de la hepatitis C (HCV), o una construcción de expresión que exprese dicha molécula, comprendiendo dicho procedimiento:

a) seleccionar la región del intermedio de replicación de hebra no codificante correspondiente a la región 3' no traducida conservada de dicho virus HCV como diana;

b) diseñar una molécula efectora de ARN bicatenaria para orientarse selectivamente a dicha región del intermedio de replicación de hebra no codificante, comprendiendo dicha molécula efectora de ARNbc una hebra efectora que tiene una secuencia de al menos 19 nucleótidos contiguos de un complemento inverso de dicha región del intermedio de replicación de hebra no codificante; y

c) producir dicha molécula efectora de ARNbc o una construcción de expresión que exprese dicha molécula.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende diseñar una molécula efectora de ARNbc de modo que la hebra efectora se asocie preferiblemente con el complejo RISC en comparación con el complemento efector.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa b) comprende predecir la termoestabilidad relativa del ARN bicatenario en el extremo 5' y 3' de la hebra efectora, y seleccionar una molécula efectora de ARNbc si el extremo 5' de la hebra efectora está presente en una cadena doble con menor estabilidad que su extremo 3'.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia efectora es de aproximadamente 19 a aproximadamente 27 nucleótidos de longitud.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha construcción de expresión comprende además uno o más promotores seleccionados de un promotor de ARN polimerasa II y un promotor de ARN polimerasa III, en el que dichos uno o más promotores se disponen en la construcción para controlar la expresión de dichas moléculas efectoras de ARNbc.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha construcción de expresión comprende al menos dos promotores de ARN polimerasa III diferentes.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha construcción de expresión comprende al menos tres promotores de ARN polimerasa III, en el que dichos al menos tres promotores de ARN polimerasa III pueden ser iguales o diferentes.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha construcción de expresión comprende al menos dos moléculas efectoras de ARNbc diferentes.

9. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que al menos una de las una o más moléculas efectoras de ARNbc es una construcción de horquilla bc.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha horquilla bc se selecciona de una horquilla bc de un tallo, una horquilla bc de dos dedos y una horquilla bc de múltiples dedos.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha secuencia efectora tiene una A o U en posición 1 del extremo 5' de dicho complemento inverso.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además formular dicha molécula efectora de ARNbc o construcción de expresión como una composición terapéutica.

13. Procedimiento in vitro de inhibición de la replicación de un virus de ARN monocatenario que ha infectado una célula de vertebrado, que comprende producir una molécula efectora de ARNbc o un vector de expresión según un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y administrar dicha molécula efectora de ARNbc o vector a dicha célula de vertebrado.